劉文穎，谷瑞增，魯軍，潘興昌，蔡木易*

 中國食品發酵工業研究院，北京市蛋白功能肽工程技術研究中心(北京100015)

摘要為了考察小麥低聚肽中抗氧化肽的活性和結構，試驗以谷朊粉為原料，采用兩步酶解法制備出小麥低聚肽，在對其基礎理化成分進行分析的基礎上，測定了其總抗氧化活性。結果表明，小麥低聚肽中總蛋白質含量為98.32%±7.25%，酸溶蛋白質含量為93.71%±7.10%，脂肪含量為0.05%±0.01%、灰分含量為4.35%±0.46%、水分含量為4.28%±0.33%。小麥低聚肽的總抗氧化能力為2.3±0.1 m mol/100 g。然后利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)對小麥低聚肽進行分離純化，收集6個主要的組分峰，利用Q-TOF質譜儀測定肽序列，鑒定出的15個肽段中，有3個肽段PY、LY和APSY的總抗氧化能力比小麥低聚肽強，分別為3.0±0.2，2.7±0.2和2.4±0.1 m mol/100 g。

關鍵詞  小麥低聚肽；分子量分布；抗氧化肽；分離純化；結構鑒定

 人體產生的自由基及其誘導的氧化反應與多種疾病密切相關，并可加速人體衰老。抗氧劑能有效清除自由基，延緩人體衰老和預防疾病。人工合成的抗氧化劑如BHT、BHA雖然抗氧化效果很好，但對人體有潛在的毒副作用，加上人們日益追求環保，因此，近年來尋找天然、安全的生物抗氧化劑成為國內外的研究重點。天然抗氧化活性肽因具有較強的活性和很高的安全性，而備受科研工作者的關注，已成為目前的研究熱點。

 小麥低聚肽是以谷朊粉為原料，經過酶解、分離、純化等制成的小分子肽混合物，具有多種生理活性，如抗氧化、增強免疫和緩解疲勞等。目前，國內外對小麥低聚肽的抗氧化活性缺乏深入和系統的研究，并且發揮作用的具體活性肽段的結構并不明確。試驗以谷朊粉為原料，通過兩步酶解法制備出小麥低聚肽，在對其基礎理化成分進行分析的基礎上，以反相高效液相色譜( RP-HPLC)、四極桿飛行時間串聯質譜儀( Q-TOF MS)為檢測手段，對小麥低聚肽中的抗氧化肽段進行分離純化和結構鑒定，以期明確小麥低聚肽中抗氧化肽的活性及其結構，旨在為天然、安全的抗氧化保健食品的開發奠定一定的理論基礎。

1  材料和方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料

 谷朊粉：北京中食海氏生物技術有限公司；堿性蛋白酶、中性蛋白酶：諾維信生物技術有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒（FRAP法）：碧云天生物技術研究所；乙腈：美國Fisher公司，色譜純；三氟乙酸：英國Alfa Aesar公司，分析純。

1.1.2儀器與設備

 HH-4數顯恒溫水浴鍋：普瑞斯機械有限公司；YG30噴霧干燥機：無錫市陽光干燥設備廠；LC-20AD型高效液相色譜儀：日本島津公司；Q-TOF2正交加速電噴霧串聯質譜儀：英國Micromass公司；SpectraMR酶標儀：美國DYNEX公司。

1.2方法

1.2.1小麥低聚肽的制備

 將谷朊粉溶解于蒸餾水中，濃度為10%→用均質機均質10 min→調節pH為8.5，溫度為55 0C，以每克蛋白質2 500單位的酶量加入堿性蛋白酶，酶解2h→調節pH為7.0，溫度保持45℃，以每克蛋白質2 500單位的酶量加入中性蛋白酶，酶解2 h→升溫至100 0C,滅酶10 min→6 000×g離心15 min，取上清液→用截留分子量為2×106 u的陶瓷膜過濾，取中間清液→用截留分子量為1000 u的超濾膜超濾，得到分子量小于1 000 u的濾過液→噴霧干燥，得到小麥低聚肽干粉

1.2.2小麥低聚肽的基礎理化成分測定

 蛋白質含量測定采用GB/T 5009.5規定的方法，以干基計，蛋白質換算系數為6.25;酸溶蛋白質含量測定采用三氯乙酸法；脂肪含量測定采用GB/T 5009.6規定的方法；灰分含量測定采用GB/T 5009.4規定的方法；水分含量測定采用GB/T 5009.3規定的方法。

1.2.3總抗氧化能力測定

  使用總抗氧化能力檢測試劑盒（FRAP法）。該法原理為酸性條件下抗氧化物可以還原Fe3+-三吡啶三吖嗪（Fe3+-TPTZ）產生藍色的Fe2+-TPTZ，隨后在593nm測定藍色的Fe2+-TPTZ即可獲得樣品中的總抗氧化能力。試驗操作步驟參考試劑盒說明書進行。

1.2.4小麥低聚肽的分離純化

采用RP-HPLC對小麥低聚肽進行分離純化。色譜條件為樣品質量濃度：10 mg/m L;流動相A：V（水）：V（三氟乙酸）=100：0.1;流動相B：V（乙腈）：V（水）：V（三氟乙酸）=80：20：0.1;檢測波長：UV 220 nm;流速：0.6 m L/min；柱溫：320C；進樣體積：50ILL。梯度洗脫程序：0～50 min．0~15%流動相B; 50～120 min，15%～40%流動相B：120～140 min，40%～80%流動相B；140.01 min, 0%流動相B。分管收集6個組分峰，利用氮吹儀除去乙腈、三氟乙酸等有機溶劑，真空冷凍干燥，得各組分干粉備用。

1.2.5抗氧化肽的結構鑒定

 采用Q-TOF2正交加速電噴霧串聯質譜儀進行結構鑒定，質譜條件為：離子化方式：納升電噴霧正離子；霧化氣體：N2；碰撞氣體：A r;源溫：80℃；錐孔電壓：50V; TOF加速電壓：9.1 kV;  MCP檢測器電壓：2 150 V;毛細管電壓：800 V; MS和MS/MS的質量準確度：0.1 n。首先進行一級質譜掃描，得到ESI-MS圖。從ESI-MS圖中選出待測離子，然后進行ESI-MS/MS分析。質譜圖經Micromass的Max Ent 3轉換后，由Peptide Sequencing推導出肽段序列。

1.2.6數據統計分析

 每組試驗重復3次，采用Excel計算不同指標的平均值和標準偏差，所有圖中誤差值采用SD值。

2結果與討論

2.1小麥低聚肽的基礎理化成分

 結果顯示，小麥低聚肽中總蛋白質干基含量為98.32%±7.25%，酸溶蛋白質含量為93.71%±7.10%．占總蛋白質95.31%。脂肪含量為0.05%±0.01%、灰分含量為4.35%±0.46%、水分含量為4.28%±0.33%。小麥低聚肽中蛋白質含量很高，酸溶蛋白質所占比例較大，說明小麥低聚肽的主要成分是較低分子量的肽類物質以及少量的游離氨基酸。

2.2小麥低聚肽的總抗氧化能力

 試驗結果表明，小麥低聚肽的總抗氧化能力為

2.3±0.1 m mol/100 g。

2.3小麥低聚肽的分離純化

 小麥低聚肽是由多種肽段組成的小分子肽的混合物。通過進一步研究，可找到小麥低聚肽中發揮活性的主要組分。目前，分離純化方法主要有高效液相色譜、離子交換層析、凝膠過濾色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳、超濾等。其中，RP-HPLC法是根據肽的極性大小而達到分離樣品的目的，能夠達到很好的分離效果，是最常用也是最有效的分離純化方法，具有操作簡便、分辨率高、重復性好和色譜過程穩定等優勢。小麥低聚肽的分離色譜圖如圖1所示，依據峰形、峰高、峰面積和分離度四個指標，收集了6個組分峰，分別命名為1*~6*，每個組分峰里含有的可能不是單一肽段，通過質譜分析便可對肽段進行鑒定。

2.4小麥低聚肽中抗氧化肽的結構鑒定

 利用Q-TOF質譜儀對收集的6個RP-HPLC組分進行分析。Q-TOF質譜儀采用電噴霧離子源(ESI)和飛行時間質量分析器( TOF)，通過對各個組分二級質譜的碎片離子的質譜圖解譜得到肽段的氨基酸序列結構。Q-TOF是蛋白測序的一種新方法，最強大的功能是能夠對蛋白質進行測序，優點是樣品用量少，并且能夠測定肽段的序列。從小麥低聚肽的RP-HPLC組分中鑒定出的肽段結構如表1所示。這些肽段序列的分子量均在1 000 u以下，分別為二肽、三肽和四肽。

 將這些肽段合成標準品，測定其總抗氧化能力。15個肽段中，有3個肽段的總抗氧化能力比小麥低聚肽強，其中PY的總抗氧化能力最強，為3.0±0.2 m mol/100 g，其次是LY和APSY，分別為2.7±0.2 m mol/100 g和2.4±0.1 m mol/100 g。這三個抗氧化肽的C末端都是酪氨酸，推測酪氨酸可能對這些肽段的抗氧化活性起到了一定的作用。其余肽段的總抗氧化能力較弱，但這些肽段與抗氧化肽段的協同作用可能對整體小麥低聚肽的總抗氧化能力有一定的作用。

3結論

  試驗以谷朊粉為原料制備小麥低聚肽，其總蛋白質含量為98.32%±7.25%，酸溶蛋白質含量為93.71%±7.10%，脂肪含量為0.05%±0.01%、灰分含量為4.35%±0.46%、水分含量為4.28%±0.33%。小麥低聚肽的總抗氧化能力為2.3±0.1 m mol/100 g。利用RP-HPLC對其進行分離純化，收集6個主要的組分峰，利用Q-TOF質譜儀測定肽序列，鑒定出的15個肽段中，PY、LY和APSY的總抗氧化能力比小麥低聚肽強，分別為3.0±0.2，2.7±0.2和2.4±0.1 m mol/100 g，推測這些抗氧化肽C末端的酪氨酸對抗氧化活性起到了一定的作用。試驗明確了小麥低聚肽的抗氧化活性，并對其含有的抗氧化肽進行了分離和結構鑒定，為小麥低聚肽作為抗氧化保健食品的開發利用提供了理論支持。