羅明有1，游玲2，潘玲玲1，邱樹毅1，王濤2，馮學愚3

 1．貴州大學（貴陽550025）；2．宜賓學院(宜賓644000)；3．成都師范學院（溫江611130）

摘要采用平板透明圈法，從分離自濃香型白酒糟醅中的110株酵母中篩選到3株能在酸性條件下分解纖維素的菌株，對其進行系統(tǒng)發(fā)育分析，顯示這3株酵母分別為Lodderomyces elongisporus和Debaryomyces hansenii;對其中1株酵母開展產(chǎn)酶條件的初步研究，表明在32 0C，pH 5.8的麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h，發(fā)酵液中纖維素酶活性高達1.84U．mL-1。

關鍵詞  濃香型白酒；酵母菌；纖維素酶

  纖維素是重要的可再生資源，隨著不可再生資源的日益枯竭，利用生物技術轉化纖維素具有重大意義。纖維素的高效降解和利用一直是科研難題，其降解分為酸降解、堿降解、熱降解、氧化降解和生物降解，其中生物降解是主要方向。

  微生物因其繁殖快、代謝類型多，一直是纖維素酶的主要來源，目前報道能產(chǎn)纖維素酶的微生物主要為細菌和霉菌，酵母罕見報道，僅見R．Potjewijd等分離自海洋和水果的Aureobasidium pullulans和Candida guillermondii兩株產(chǎn)纖維素酶酵母報道。同時，由于酵母基因組易于改造，以釀酒酵母為載體構建了大量基因工程菌，Jungu Bae等研究了利用重組釀  酒酵母生產(chǎn)燃料乙醇，但重組酵母可能對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不確定影響。因此，尋找能夠直接降解纖維素的酵母菌株仍是重要研究方向。

 試驗從濃香型白酒糟醅中篩選到3株可穩(wěn)定降解纖維素的酵母菌株，并對其中1株酵母開展產(chǎn)纖維素酶條件初步研究，為該酵母在釀造行業(yè)及其他相關產(chǎn)業(yè)中的應用提供理論依據(jù)。

  1材料與方法

  1.1菌株

 四川省宜賓市某濃香型白酒廠糟醅中分離的110株酵母菌株，現(xiàn)保存于固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室。

  1.2培養(yǎng)基

 YPD培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基，均用Na2HPO4-檸檬酸緩沖液調節(jié)pH至5.8。

 產(chǎn)酶發(fā)酵基礎培養(yǎng)基：1%羧甲基纖維素鈉，0.4% (NH4)2SO4, 0.2% KH2PO4, 0.05% MgSO4·7H2O,1%蛋白胨，0.5%牛肉膏。

  1.3產(chǎn)纖維素酶酵母菌的篩選與系統(tǒng)發(fā)育分析

  1.3.1產(chǎn)纖維素酶酵母菌的篩選

 菌株活化后接種于加有微晶纖維素的YPD平板中，28℃倒置培養(yǎng)3d，0.1%的剛果紅溶液染色15 min后以1 mol/L的氯化鈉溶液脫色15 min，觀察，將有透明圈的菌株反復接種于加有微晶纖維素的YPD平板中，培養(yǎng)，采用剛果紅染色法測量透明圈直徑與菌落直徑，選出穩(wěn)定高產(chǎn)纖維素酶菌株。

  1.3.2產(chǎn)纖維素酶酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

 DNA的提取及系統(tǒng)發(fā)育分析的方法。

  1.4酶活測定

 參見GB/T 23881-2009。

  1.5酵母產(chǎn)纖維素酶條件研究

  1.5.1溫度對酵母產(chǎn)纖維素酶的影響

 將接種的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基分別置于28℃，30℃，32℃和34℃恒溫搖床培養(yǎng)，每隔12 h檢測纖維素酶活。

  1.5.2 pH對酵母產(chǎn)纖維素酶的影響

 將菌株接種于初始pH為5.4，5.8，6.2和6.6的產(chǎn)酶發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中，32℃恒溫搖床培養(yǎng)，每隔12 h測定酶活。

1.5.3誘導物對酵母產(chǎn)纖維素酶的影響

 將菌株分別接種于YPD培養(yǎng)基和麥芽汁培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)，每隔12 h檢測纖維素酶活；同時加入微晶纖維素作為誘導物質，每隔12 h檢測纖維素酶活力。

2結果與分析

2.1纖維素降解菌的篩選

 將從110株酵母中初篩得到的20株酵母菌在YPD固體培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落接種于加有微晶纖維素的YPD平板中，培養(yǎng)，染色后測量透明圈大小，結果如表1。

 從表1可以看出，20株菌經(jīng)再次傳代培養(yǎng)染色后共得到17株具有分解纖維素能力的菌株，但經(jīng)過15次傳代培養(yǎng)后仍可降解纖維素的僅3株，其編號分別為S633y-28-1，S533y-36和H6y-22，比例僅為2.7%。

 將穩(wěn)定產(chǎn)酶的S633y-28-1、S533y-36和H6y-22菌株純化后培養(yǎng)，染色，并測量透明圈直徑和菌落直徑，結果如表2。

 由表2可得，3株穩(wěn)定產(chǎn)酶菌株經(jīng)15次傳代培養(yǎng)后，其H/D值情況為：S533y-36>S633y-28-1>H6y-22，表明S533y-36菌株產(chǎn)纖維素酶的能力最高。

2.2產(chǎn)酶菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析

 經(jīng)PCR擴增，測序，所得序列與Gen Bank數(shù)據(jù)庫中的酵母菌標準菌株對應序列比對，3株菌分屬2個屬，菌株S633y-28-1和H6y-22與模式菌株Lodderomyces elongisporus( GenBank: EF394940.1)的序列相似性為99%，菌株S533y-36與模式菌株Debaryomj，ceshansenii( GenBank:  HQ860269.1)的序列相似性為100%，表明S633y-28-1和H6y-22菌株為Loddero，r0，ces

elongisporus,S533y-36為Debaryomyces hansenii，利用MEGA6軟件對3株菌及模式菌株構建系統(tǒng)發(fā)育樹也印證了上述鑒定結果（圖1）。

2.3 S533y-36菌株生長與產(chǎn)纖維素酶的關系

 由于S533y-36菌株在平板試驗中體現(xiàn)出更好的酶活性，故選擇S533y-36菌株進行產(chǎn)酶條件研究。首先，在YPD培養(yǎng)基（自然pH）中32 0C下培養(yǎng)，通過測定OD560nm監(jiān)測酵母生長狀況，分析S533y-36菌株生長與產(chǎn)纖維素酶的關系，如圖3所示。

 可以看出，S533y-36酵母菌株在接種12 h內生長緩慢，12 h后其OD560nm呈現(xiàn)對數(shù)生長趨勢，在36 h達到最大值，之后進入穩(wěn)定期，其后基本維持穩(wěn)定，直至60 h左右由于酵母自溶或絮凝沉降導致OD560nm下降。產(chǎn)酶曲線與之相似，表明該菌株生長與產(chǎn)酶大致同步。但24～36 h之間，酶活性的增長速率明顯慢于酵母細胞數(shù)量的增長速率，表明對數(shù)后期形成的酵母細胞產(chǎn)酶能力較低。一方面可能是由于酵母代謝廢物累積抑制了其酶活性；另一方面，纖維素酶可由酶促反應的產(chǎn)物和類似底物的某些物質引起競爭性抑制，比如纖維二糖、葡萄糖和甲基纖維素通常是纖維素酶的競爭性抑制劑，由于對數(shù)前期產(chǎn)生較多的纖維二糖等物質，導致對數(shù)后期酶活受到抑制。

2.4溫度對S533y-36菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

 酵母的最適生長溫度為290C～30℃，發(fā)酵時的溫度一般為30℃～32℃，試驗研究的是篩選自白酒糟醅的酵母菌株，故設置溫度范圍為28℃～34℃，其在不同培養(yǎng)溫度下酶活如圖3所示。

 由圖3可知，在28℃和30℃的較低溫度時，產(chǎn)酶相對較低。一方面，溫度較低時，微生物的代謝緩慢，酶的生成速率低；另一方面，纖維素酶是胞外酶，其結合于細胞膜上，當溫度較低時不利于細胞膜的流動，酶的釋放緩慢。當為32℃時，其產(chǎn)酶效果最好，從24 h后一直處于最高，但是當溫度高于32℃時，產(chǎn)酶降低，推測是溫度過高導致酵母細胞提早衰老死亡，從而代謝能力減弱。由此可得，該酵母菌株的最適產(chǎn)酶溫度為32℃。

2.5 pH對S533y-36菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

 由于該株酵母生長于酸性環(huán)境，故試驗初始pH設置為5.4，5.8，6.2和6.6，其在不同的初始pH下酶活如圖4所示。

 由圖4可知，在培養(yǎng)基初始pH為5.8時，培養(yǎng)液中纖維素酶活性達0.45 U．mL-1，其次是pH 6.2，當培養(yǎng)基初始pH為5.4或6.6時，培養(yǎng)36 h時的培養(yǎng)液中纖維素酶活性分別降低14.5%和21.7%，說明酶活性受初始pH影響較大，這可能是由于pH-方面影響酵母生長，即影響產(chǎn)酶細胞的數(shù)量，另一方面，H+本身可能對產(chǎn)酶相關代謝途徑或酵母細胞膜通透性有一定影響。對該酵母菌而言，其產(chǎn)纖維素酶的最適pH為5.80

2.6微晶纖維素對S533y-36菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

 基于對溫度和pH的研究，將該酵母菌接種到pH5.8的麥芽汁培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)，監(jiān)測培養(yǎng)液中纖維素酶活性變化，探究微晶纖維素對該酵母菌株在兩種培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶情況，結果如圖5和6所示（試驗組添加微晶纖維素，對照組不加）。

 由圖5和6可以看出，微晶纖維素在兩種培養(yǎng)基中均可誘導S533y-36菌株產(chǎn)纖維素酶，且其趨勢相似，兩種培養(yǎng)基的處理及對照均在36 h左右酶活性達到最高，在YPD培養(yǎng)基中處理的最高酶活性高于對照22.2%，麥芽汁培養(yǎng)基中處理的最高酶活性高于對照22.4%，特別是在YPD培養(yǎng)基中，36 h后試驗組與對照組的纖維素酶活性差距進一步擴大，到60 h達到26.7%。

 同時，可以看出，該酵母菌在麥芽汁培養(yǎng)基中的最高酶活比YPD培養(yǎng)基高27.4%，可能與S533y-36菌株的代謝調控有關，麥芽汁培養(yǎng)基中主要含麥芽糖等二糖類物質，而YPD培養(yǎng)基中主要是葡萄糖，S533y-36菌株在含有葡萄糖時會首先利用葡萄糖作為碳源，不會直接誘導產(chǎn)生各種酶分解其它二糖和多糖類物質，另外，培養(yǎng)基中的葡萄糖對纖維素酶生成具有反饋抑制作用，因此出現(xiàn)上述情況。

3結論

  篩選的S533Y-36菌株在32℃，pH 5.8的麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h，發(fā)酵液中纖維素酶活性高達1.84U．mL-1，故表明該菌具備在偏高溫( 32℃)、偏酸性條件下( pH 5.8)短時間(36 h)內產(chǎn)生較高纖維素酶的能力，且篩選自白酒糟醅，其安全性和可靠性較好，不會對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生破壞，對營養(yǎng)要求不高，故可以用于飼料和釀造行業(yè)以及其他相關行業(yè)中，降低生產(chǎn)成本，得到較好的產(chǎn)品。