袁林1，郭建軍1，王賢卓1 ，2，曾靜1，杜建華3

  1．江西省科學院微生物研究所（南昌330096）；2．南昌大學中德聯合研究院（南昌330029）；3．南昌工學院（南昌330108）

摘要研究了培養基組分（蔗糖、米糠和L-抗壞血酸）及發酵條件(pH、溫度、接種量和轉速)對茁芽短梗霉P1012 (Aureobasidium pullulans P1012)產普魯蘭多糖的影響，以期提高普魯蘭多糖的產量。研究對培養基組分進行單因素試驗及優化發酵條件，再結合正交試驗考察了三因素（米糠、蔗糖和L-抗壞血酸）兩水平對普魯蘭多糖產量的影響，從而優化茁芽短梗霉P1012發酵工藝，并通過上5L發酵罐發酵培養驗證。試驗確定最佳培養基配方為蔗糖70 g/L、米糠3g/L和L-抗壞血酸3 g/L。發酵條件控制為溫度28℃、pH 5.0、接種量4%以及轉速200 r/min。經5L發酵罐培養后，測定普魯蘭多糖產量達到43.77 g/L,糖轉化率為62.53%。發酵液pH由5.00升至6.56，黏度達到52.10mPa．s，具有特別的芳香氣味。獲得茁芽短梗霉P1012的發酵工藝參數，為進入工業化生產提供依據。

關鍵詞  茁芽短梗霉；普魯蘭；正交試驗：發酵工藝

 茁芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）屬于半知菌類短梗霉屬，是一種具有多細胞形態的腐生真菌，可合成兩種胞外多糖：普魯蘭多糖和β-葡聚糖（不溶于水的果凍狀物質）。其中，普魯蘭多糖又稱為短梗霉多糖，是一類以a(1→6)糖苷鍵鏈接的麥芽三糖重復單位，具有溶解性、阻氧性和可降解性等特性，現被廣泛運用于食品加工、醫藥和環境保護等行

業中。盡管普魯蘭多糖具有很多特性及巨大的應用前景，但市場上商業化成品還較少。究其原因在于價格過高，達到160元/kg，是其他的多糖（如黃原膠）價格的三倍。因此探究使用價廉原料作為碳源、氮源等其他培養基組分，可降低普魯蘭多糖的生產成本，促進普魯蘭行業的發展。Wang等利用谷殼水解物作為碳源用于茁芽短梗霉的發酵生產，較少原料成本。Sharma等研究了利用米糠油餅、大豆油餅、棉花籽油餅、芥末籽油油餅和玉米漿為氮源發酵生產，結果發現玉米漿最利于提高普魯多糖產量，達到77.92 g／L。Seo等研究發現黃豆渣作為碳源，比酵母的效果更好，普魯蘭產量達到5.5 g/L。Goksungur等運用響應面發優化馬鈴薯水解物培養基，測得Aureobasidiumpullulans P56普魯蘭多糖產量為19.2 g/L。試驗前期通過復合誘變過程，選育出一株茁芽短梗霉P1012，但未研究優化其培養基組分及發酵條件。研究采用蔗糖為碳源，米糠作為氮源及其他微量元素的來源，并使用L-抗壞血酸作為特殊添加物，促進普魯蘭多糖的合成。試驗采用單因素試驗、正交試驗，最終獲得茁芽短梗霉P1012產普魯蘭多糖的發酵工藝，并通過發酵罐驗證，從而提高普魯蘭多糖的產量，降低生產成本。

1材料與方法

1.1菌種與培養基

 茁芽短梗霉P1012(Aureobasidium pullulansP1012)由實驗室分離的菌株P23作為原始菌株，經紫外線、亞硝基胍和硫酸二乙酯復合誘變處理篩選獲得。

 PDA斜面培養基(g/L)：馬鈴薯200，瓊脂粉20，葡萄糖20。

 種子培養基( g/L)：蔗糖20，酵母粉5，自然pH。

 發酵培養基( g/L)：蔗糖50，米糠3，L-抗壞血酸2。

1.2方法

1.2.1菌種活化及菌液制備

 從斜面（茁芽短梗霉P1012）上挑取一環種子接種于試管中，28℃，180 r/min搖床培養48 h。按2%的接種量，將活化的菌種液接種于種子培養基中，28℃，180 r/min搖床培養48 h。

1.2.2單因素試驗

 研究不同濃度的蔗糖(0，50，60，70，80和90 g/L)，米糠（0，3，4，5和6 g/L）和L-抗壞血酸（0，1，2，3和4 g/L）對普魯蘭多糖產量的影響，獲得培養基組分的最佳濃度水平，為正交試驗設計提供依據。

1.2.3正交試驗

  對培養基組分（蔗糖、米糠和L-抗壞血酸）進行三因素兩水平正交試驗設計。用正交試驗設計助手3.1軟件對試驗數據進行分析，以糖轉化率(%)作為衡量指標。

1.2.4發酵條件優化試驗

 考察溫度(20℃，22℃，24℃，26℃，28℃和30℃)，pH（4.0，4.5，5.0，5.5，6.0和6.5），接種量（2%，4%，6%，8%和10%），轉速(100，150，200和250 r/min)對普魯蘭多糖發酵生產的影響。

1.2.5發酵罐驗證發酵工藝

  基于最優的發酵工藝，將活化的種子液接種于SL發酵罐（上海保興生物設備工程有限公司），裝液量為3.5 L，通氣量2L/min。發酵周期為4d，每隔12 h取一次樣，凍存于-80℃超低溫冰箱中。發酵結束后，取出所有樣品，測定生物量，普魯蘭產量等參數，并繪制發酵曲線。

1.2.6分析方法

  1)生物量：發酵液于12 000 r/min下，離心5 min．并收集菌體。將菌體于105℃烘箱過夜，電子天平稱重。

 2)普魯蘭產量：取發酵液離心后的上清液，加入兩倍體積的無水乙醇，靜止4h。15 000 r/min下，離心8 min，收集多糖沉淀。將多糖沉淀于真空冷凍干燥機內過夜干燥，電子天平稱其質量。

 多糖的轉化率=普魯蘭產量( g/L)，培養基中蔗糖含量( g/L)×100% (1)

 3) pH:發酵罐在線測定（Mettler pH電極）

 4)溶氧( DO)值：發酵罐在線測定(Mettler DO電極)。

 5)發酵曲線繪制：統計各個發酵參數，并使用軟件Sigma plot 12.0繪制發酵曲線。

 6)發酵液的黏度：使用ND-J5S旋轉黏度計（上海昌吉地質儀器有限公司）測定。

2結果與討論

2.1培養基組分的單因素試驗

 由表1—3可知，增加蔗糖濃度，可提高普魯蘭多糖的產量，但糖轉化率也隨之降低。米糠作為氮源及微量元素的來源，對普魯蘭的產量影響較大，最適濃度為4 g/L。L-抗壞血酸作為抗氧化劑，抑制菌體褐化反應，提高普魯蘭的產量。研究表明，除了L-抗壞血酸外，大豆油、尿嘧啶和吐溫_80等物質，也可以提高普魯蘭的產量。因此普魯蘭多糖產量最高的培養基組成濃度為蔗糖70 g/L、米糠4 g/L以及抗壞血酸2 g/L，可作為正交試驗的濃度水平依據。

2.2影響產普魯蘭多糖的發酵條件優化

 由表4～7可知，溫度、pH、接種量和轉速對普魯蘭的產量都有明顯影響。最適的溫度為28℃，pH5.0。有研究表明高溫，低pH有利于普魯蘭多糖的合成。接種量過低或過低都不利于普魯蘭多糖的合成，原因在于接種量低時，更多養分用于菌體的生長，發酵周期延長，而接種量過大，則會影響溶氧。轉速的大小影響溶氧，盡管茁芽短梗霉屬于好氧真菌，但過高的溶氧會對細胞質膜形成傷害。因此采用接種量4%，轉速200 r/min。

 由表8的極差值R和表9方差分析可見，影響普魯蘭多糖產量的培養基組分的順序為蔗糖>L-抗壞血酸(g／L)>米糠，且所有的培養基組分對普魯蘭多糖產量的影響具有顯著意義(p<0.05)。由試驗結果分析可得茁芽短梗霉P1012培養基的最佳組合為蔗糖70g/L；米糠3g/L; L-抗壞血酸3 g/L。

2.3發酵罐驗證發酵工藝

 在搖瓶優化發酵條件的基礎上，進行了5L發酵罐的擴大培養。裝液量為3.5 L，加消泡劑0.5%，用Na OH溶液調pH到5.0，115℃滅菌30 min，培養溫度28 0C，攪拌轉速200 r/min，通氣量2 L/min。發酵4d結束，此試驗重復3次。試驗結果如圖1。

 從圖1可以看出，pH在0～24 h時間段內，變化較小，但24～72 h內，pH不斷升高，最高達到6.75左右，隨后就開始降低，而使用通用培養基時，pH變化是不斷下降的過程；溶氧量( DO)從100%降到28.3%，說明茁芽短梗霉是好氧的微生物；發酵72 h后，開始產生特殊的芳香氣味；發酵96 h后，黏度達到52.10mPa．s，普魯蘭多糖產量達到43.77 g/L，糖轉化率為62.53%。由于發酵罐的攪拌和通氧條件均優于搖瓶發酵，因此，普魯蘭多糖產量和糖轉化率都明顯好于搖瓶發酵。

3結論

  通過單因素試驗及正交試驗，最終確定茁芽短梗霉P1012最佳發酵工藝參數：蔗糖70 g/L，米糠3g/L，L-抗壞血酸3 g/L，溫度28℃，接種量4%，pH 5.0，轉速200 r/min。基于最佳發酵工藝，測得出茁芽短梗霉P1012的普魯蘭多糖產量達到43.77 g/L，糖轉化率為62.53%，黏度為52.10 mPa．s，具有特殊的芳香氣味。試驗采用的培養基（米糠、蔗糖和L-抗壞血酸）組分簡單，價格低廉，可為降低普魯蘭多糖的生產成本提供了參考。