戴彥韻，胡子峰，鮑笑嶺，裴煒

 上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院／國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（上海200233）

摘要建立了以鹽酸+L -半胱氨酸為提取液，采用高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用技術(shù)測(cè)定嬰幼兒輔食中的汞的形態(tài)的分析方法。在優(yōu)化條件T,3種汞化合物的線性范圍為0~50μg／L，相關(guān)系數(shù)(r)均優(yōu)于0.999 0，檢出限在3.70-7.71μg/kg之間，3種汞化合物加標(biāo)回收率均在89.6%~107%之間，重現(xiàn)性RSD=3.5%，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)魚肉(GBW 10029)的測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)。選擇市場(chǎng)上常見種類的嬰幼兒輔食進(jìn)行檢測(cè)，甲基汞含量在11.3～12.5μg/kg之間。

關(guān)鍵詞嬰幼兒輔食；汞；甲基汞；形態(tài)分析；高效液相色譜；原子熒光

 汞是一種毒性較大、熔點(diǎn)低、易揮發(fā)的重金屬，在自然界中以單質(zhì)汞、無(wú)機(jī)汞和有機(jī)汞的形態(tài)存在。汞的毒性與其存在形態(tài)密切相關(guān)，有機(jī)汞毒性大于無(wú)機(jī)汞，其中又以甲基汞毒性為最強(qiáng)。甲基汞是脂溶性分子，易于穿透生物膜，在人體胃腸道中的吸收高達(dá)95%。甲基汞極易通過(guò)血腦屏障和胎盤屏障，在胎兒的腦部和其他組織蓄積，阻滯胎兒腦部發(fā)育。

 我國(guó)食品中污染物限量標(biāo)準(zhǔn)( GB 2762-2012)規(guī)定食肉魚類和非食肉魚類的甲基汞限量分別為1.0mg/kg和0.5 mg/kg，規(guī)定嬰幼兒罐裝輔助食品總汞限量值為0.02 mg/kg，而對(duì)汞的形態(tài)沒(méi)有要求。2013年4月，媒體報(bào)出多家知名品牌以深海魚類為原料的嬰幼兒罐裝輔助食品樣品有總汞含量超標(biāo)情況，引起社會(huì)對(duì)甲基汞危害的強(qiáng)烈關(guān)注。由于嬰幼兒輔食限量值僅為0.02 mg/kg，而嬰幼兒輔食中廣泛添加深海旗魚和金槍魚等肉食性魚類，這就需要一種更加簡(jiǎn)單快捷、檢出限低和重復(fù)性好的檢測(cè)方法。

 目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)甲基汞的測(cè)定方法主要集中在HPLC-AFS和HPLC-ICP-MS兩種方法上。HPLC-ICP-MS法靈敏度較高，但由于儀器昂貴和運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用高，對(duì)操作技術(shù)要求也較高，因而較難在我國(guó)常規(guī)實(shí)驗(yàn)室中得到普及應(yīng)用。而AFS對(duì)汞元素檢測(cè)的靈敏度可-1CP-MS相當(dāng)，同時(shí)是我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的技術(shù)，儀器價(jià)格低、操作簡(jiǎn)便易于掌握，更適合我國(guó)國(guó)情。近年來(lái)HPLC-AFS已較多地應(yīng)用于環(huán)境及食品樣品中的汞元素形態(tài)分析，并多次見報(bào)成功通過(guò)甲基汞檢測(cè)國(guó)際比對(duì)，已成為汞形態(tài)分析中可靠的檢測(cè)方法之一。試驗(yàn)建立了以鹽酸+L-半胱氨酸為提取液，采用高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀測(cè)定嬰幼兒輔食中的汞的形態(tài)的方法，滿足了嬰幼兒輔食檢測(cè)工作量大、檢出限低的要求，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

1試驗(yàn)部分

1.1試劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液

 汞單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、甲醇中甲基汞溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、甲醇中乙基汞溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、魚肉中總汞與甲基汞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)( GBW 10029)：中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；乙腈（色譜純）、L-半胱氨酸：SIGMA;乙酸銨( GR)：沃凱；氫氧化鉀、氨水、鹽酸、硼氫化鉀、過(guò)硫酸鉀：分析純，國(guó)藥集團(tuán)。

1.2儀器裝置和分析條件

 液相色譜：Agilent 1200液相色譜儀（美國(guó)安捷倫），Venusil MP-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5μm，美國(guó)Agela)，流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)5.0%的乙腈-0.05 mol/L乙酸銨-1 g/L L-半胱胺酸，流速1 m L/mm，進(jìn)樣量80μL。

 原子熒光：AFS 9800（配備高強(qiáng)度在線紫外消解，北京海光），點(diǎn)火，負(fù)高壓300 V，汞燈電流30m A；載液為體積分?jǐn)?shù)5%的HCI，泵速50 r/min；還原劑0.5 g/L硼氫化鉀-0.1 g/L氫氧化鉀溶液，泵速50 r／min；載氣400 m L /min，屏蔽氣600 m L /min。

 DMA-80自動(dòng)測(cè)汞儀（意大利Milestone公司），進(jìn)樣量0.1 g。

1.3汞形態(tài)分析前處理方法

 將樣品粉碎均勻后，稱取約1 g于15 m L離心管中，加入7 m L 1%體積分?jǐn)?shù)的HCl-1 g/L L-半胱氨酸提取液，渦旋振蕩，常溫下超聲提取0.5 h。待樣品冷卻后以上述提取液定容至10 m L，于4℃下以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液過(guò)0.45μm水相濾膜，上機(jī)。

1.4總汞測(cè)定方法

 總汞的測(cè)定由DMA-80自動(dòng)測(cè)汞儀完成，進(jìn)樣量為0.1 g。

2結(jié)果和分析

2.1樣品前處理方法

  試驗(yàn)樣品前處理方法參照實(shí)驗(yàn)室朱晨華等的先期研究，未做進(jìn)一步優(yōu)化處理。

2.2液相色譜分離條件

 為實(shí)現(xiàn)不同形態(tài)的汞的分離，需要在標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品提取液和流動(dòng)相中添加絡(luò)合劑。常用的絡(luò)合劑有2-巰基乙醇和L-半胱氨酸，試驗(yàn)選擇毒性較低、較容易獲得的L-半胱氨酸。尚曉虹等的研究表明，L-半胱氨酸在0.1～5 g/L范圍內(nèi)甲基汞、無(wú)機(jī)汞及乙基汞的保留時(shí)間和靈敏度均沒(méi)有明顯變化，試驗(yàn)也證實(shí)了這一結(jié)論。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)L-半胱氨酸容易失效，表現(xiàn)為3種形態(tài)的汞同時(shí)出峰，在色譜柱上均無(wú)保留，所以提取液和流動(dòng)相最好當(dāng)天配制。這可能由于L-半胱氨酸容易跟空氣中的氧氣反應(yīng)而失去絡(luò)合作用。

 根據(jù)呂超等的研究表明，當(dāng)提取液pH為2～3時(shí)，對(duì)3種形態(tài)的汞分離較好，而試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相pH對(duì)3種形態(tài)的汞出峰時(shí)間和峰形均無(wú)明顯影響。又因Venusil MP C18柱屬中等極性柱，適用pH 1.5～8.5，pH范圍較寬，所以流動(dòng)相無(wú)需調(diào)節(jié)pH，提取液也無(wú)需中和后再上機(jī)。

 Agilent 1200液相色譜儀配備四元泵和在線脫氣機(jī)，可實(shí)現(xiàn)任意比例的四元低壓混合。配制A道為0.05 mo/L乙酸銨-1 g/L L-半胱胺酸溶液，輔以任意比例的有機(jī)相（如C道甲醇，D道乙腈），可輕松實(shí)現(xiàn)流動(dòng)相有機(jī)溶劑組成和配比的優(yōu)化。經(jīng)試驗(yàn)得知，以乙腈為有機(jī)溶劑時(shí)，汞各種形態(tài)的峰形均優(yōu)于以甲醇為有機(jī)溶劑，而當(dāng)乙腈達(dá)到5%時(shí)Hg2+、甲基汞和乙基汞可實(shí)現(xiàn)基線分離，峰形對(duì)稱尖銳，如圖1。

2.3原子熒光檢測(cè)條件

 試驗(yàn)以硼氫化鉀-氫氧化鉀溶液為還原劑，并對(duì)還原劑濃度進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果表明，較高濃度的還原劑生成較多氫氣，容易將汞蒸汽稀釋，造成信號(hào)降低，最終選擇0.5 g/L硼氫化鉀-0.1 g/L氫氧化鉀溶液。

 汞化合物經(jīng)紫外消解和蒸汽發(fā)生后，進(jìn)入氣液分離器，并由載氣攜帶進(jìn)入檢測(cè)器中檢測(cè)，而載氣流速會(huì)影響信號(hào)的強(qiáng)弱。在200～800 m L/min范圍內(nèi)調(diào)節(jié)載氣流速，發(fā)現(xiàn)載氣流速的變化對(duì)保留時(shí)間基本沒(méi)有影響。但流速太低，汞蒸汽不能被及時(shí)吹入檢測(cè)器，會(huì)導(dǎo)致色譜峰較寬；流速太高，汞蒸汽又會(huì)被稀釋，導(dǎo)致信號(hào)降低。試驗(yàn)選擇400 m L/min的載氣流速。在載氣流速選定400 m L/min時(shí)，在400～900 m L/min范圍內(nèi)調(diào)節(jié)屏蔽氣流速，發(fā)現(xiàn)載氣流量過(guò)低時(shí)基線波動(dòng)較大，過(guò)高時(shí)信號(hào)降低，試驗(yàn)選擇600 m L/min的屏蔽氣流速。

  蒸汽發(fā)生原子熒光法檢測(cè)有機(jī)汞時(shí)必須先將有機(jī)汞轉(zhuǎn)變成無(wú)機(jī)汞，否則會(huì)因有機(jī)汞氫化物發(fā)生效率很低而導(dǎo)致難以檢測(cè)。有機(jī)汞轉(zhuǎn)化成無(wú)機(jī)汞常用的方法有紫外光照射或氧化反應(yīng)。試驗(yàn)所用AFS 9800儀器配備高強(qiáng)度的紫外在線消解系統(tǒng)，有6根高強(qiáng)度紫外燈管，消解管長(zhǎng)度超過(guò)5m，管徑極細(xì)，不會(huì)產(chǎn)生較大出峰延遲；系統(tǒng)還配制2個(gè)高速風(fēng)扇，可消除紫外燈長(zhǎng)時(shí)間照射造成的升溫現(xiàn)象，提高了儀器測(cè)量的重現(xiàn)性。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性范圍和檢出限

 以流動(dòng)相配制3種汞化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度分別為0，1，2，5，10, 20和50μg/L，進(jìn)行線性范圍試驗(yàn)，以峰高作定量依據(jù)，線性相關(guān)系數(shù)(r)優(yōu)于0.999 0；以3倍基線噪聲測(cè)定3種汞形態(tài)的檢出限（S/N=3），結(jié)果見表1。

2.4.2重現(xiàn)性

 由于找不到3種汞形態(tài)都存在的樣品，選擇某品牌海陸肉松（非嬰幼兒輔食，含豬肉、金槍魚肉等）為對(duì)象，平行測(cè)定6次，樣品譜圖見圖2，甲基汞測(cè)定結(jié)果見表2。

2.4.3加標(biāo)回收率

 在3種汞檢測(cè)均呈陰性的三文魚番茄泥樣品加標(biāo)，加標(biāo)回收結(jié)果見表3。

2.4.4標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定

 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 10029魚肉中甲基汞證書標(biāo)定值為0.84±0.03 mg/kg，實(shí)際測(cè)定值為0.86 mg/kg。

2.5實(shí)際樣品測(cè)定

  采用試驗(yàn)所建立的方法，對(duì)市售各類嬰幼兒輔助食品各種汞形態(tài)和總汞進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4。

3結(jié)論

  試驗(yàn)建立了以鹽酸+L-半胱氨酸為提取液，采用高效液相色譜-原子熒光聯(lián)用儀測(cè)定嬰幼兒輔食中的汞的形態(tài)的方法，滿足了嬰幼兒輔食檢測(cè)工作量大、檢出限低的要求，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。所檢測(cè)12種嬰幼兒輔食總汞均在0.02 mg/kg以下，符合GB 2762-2012相關(guān)規(guī)定。四種總汞陽(yáng)性樣品均含深海旗魚或金槍魚等肉食性魚類，總汞中，甲基汞占90.8%～95.8%，從另一方面佐證了總汞的來(lái)源是肉食性魚類的添加。

 盡管試驗(yàn)收集的樣品均符合相關(guān)規(guī)定，但從海陸肉松樣品甲基汞含量較高（104μg/kg）來(lái)看，嬰幼兒輔食中肉食性魚類添加比例較高時(shí)還是有可能引起總汞超標(biāo)，提醒人們添加肉食性魚類的嬰幼兒輔食應(yīng)是食品安全監(jiān)管的一個(gè)長(zhǎng)期的重點(diǎn)。