劉文玉1，潘軒2，魏長慶2，劉靈針3，單春會2*

1．新疆石河子職業技術學院（石河子832000）；2．石河子大學食品學院（石河子832000）；

 3．新疆百禾晶生物科技有限公司（庫爾勒841000）

摘要試驗以番茄籽油脫臭餾出物為原料，以脂肪酶為催化劑，通過酶法甲酯化，再將甲酯化產物結晶，分離甾醇后用正已烷提取維生素E的相關工藝及參數進了行研究。試驗確定脂肪酶最佳反應體系為水相體系，結合響應面優化試驗，確定最佳反應條件：料液比1：5 (mg/mL)、酶用量500 U/g、反應溫度40℃、反應時間16 h和水分含量為26%時，番茄籽油脫臭餾出物中維生素E總提取率可以達到42.78%，與模型理論預測值43.45%接近。

關鍵詞  番茄籽油；脫臭餾出物：脂肪酶；甲酯化；生育酚

  番茄籽油因其富含番茄紅素、維生素E、β-胡蘿卜素和植物甾醇等眾多營養素而越來越受廣大消費者青睞。據了解，新疆的番茄醬年產量達200多萬t，在生產過程中產生約20萬t番茄皮籽（干重計），而如果利用番茄籽生產高檔食用油，可生產4 000 t，創造10億的產值。據文獻報道，新疆番茄籽油中維生素E含量高達688～780 mg/kg，眾所周知，天然維生素E具有抗衰老、提高免疫力的作用及對心腦血管疾病有輔助治療作用，目前已被廣泛用于食品營養增補劑和抗氧化劑及醫藥、化妝品等方面。然而，在番茄籽油精煉過程中，尤其是高溫脫臭過程中會造成天然維生素E的大量損失，因此，對番茄籽油脫臭餾出物中提取天然維生素E是廣大學者探索方向之一。

 目前，維生素E提取方法主要有化學法、超臨界法、離子交換法和生物法等，其中化學法具有提取時間短，工藝簡易，但耗費有機溶劑多，維生素E損失嚴重或不純；超臨界法雖萃取率高，但是投資大，費用高；離子交換法方法簡單，損失率小，但溶劑消耗量大；生物法具有工藝流程簡單，提取率高、成本低廉并且反應條件溫和、副產物少和對天然維生素E營養功能損害小等優點，從發展前景看，利用生物法對番茄籽油脫溴溜出物的提取天然維生素E是一個重要方向。因此，試驗以番茄籽脫臭餾出物為原料，擬采用生物酶法進行天然維生素E提取工藝的研究及優化，以期為新疆番茄綜合加工利用附加值的提升提供理論和實踐依據。

1  試驗材料與方法

1.1試驗材料與設備

1.1.1材料

 番茄籽油脫臭餾出物：由新疆百禾晶生物技術有限公司提供。

1.1.2試劑

 無水甲醇（分析純）：天津市致遠化學有限公司；甲醇（色譜醇）：天津市富晨化學有限公司；正己烷（分析純）：天津市致遠化學有限公司；脂肪酶( 50 U/mg)：深圳大族鐳射科技股份無限公司；維生素E標品：食品藥品檢定院。

1.1.3試驗儀器與設備

 BS224-S萬分之一天平：美國Mettler Toledo公司；KQ-200VDE-型雙頻數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DK-8D型數顯恒溫水浴鍋：金壇市醫療儀器廠；A-1000S水流抽氣機：上海愛朗儀器有限公司；LC-2010AHT高效液相色譜儀：上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

  1.2試驗方法

  1.2.1  天然維生素E提取體系的選擇

 稱取3份10 g番茄籽油脫臭餾出物于100 m L帶密封瓶蓋的玻璃反應瓶中和甲醇(料醇比為1：4( mg/mL)，分3次等量加入）混合，第一份加入25%水，第二份加入25%的正己烷，第三份不做任何處理，分別置于恒溫水浴鍋中預熱震蕩，然后向反應體系中加入一定量脂肪酶( 400 U/g)，攪拌均勻，蓋好瓶蓋，在恒溫水浴鍋40℃酶解12 h。

  1.2.2維生素E的提取方法

 根據2.2.1試驗選擇的合適體系，稱取10 g番茄籽脫臭餾出物于100 m L帶密封瓶蓋的玻璃反應瓶中，加入25 010純凈水和甲醇(料醇比為1：4(mg/m L)，分3次等量加入），置于恒溫水浴鍋中預熱震蕩，然后向反應體系中加入400 U/g脂肪酶，攪拌均勻，蓋好瓶蓋，在恒溫水浴鍋40℃酶解12 h。反應完畢后，將混合液移入分液漏斗中進行分離，分出下層甘油層，用蒸餾水洗滌甲酯層。冷卻結晶去除甾醇(3 0C，3h)，然后真空抽濾后在3 000 r/min的條件下離心10min。取上清液在常溫下與正己烷萃取，物料與萃取劑之比為1：1( mg/m L)，最后將萃取劑蒸發冷凝回收，得天然維生素E。

  1.2.3分析方法

  在有水分存在的反應體系中，油脂既可以和甲醇發生醇解反應生成甘油和脂肪酸甲酯，油脂部分水解會生成甘油和脂肪酸，脂肪酸和甲醇發生酯化反應生成脂肪酸甲酯和水，從反應產物中萃取維生素E，并利用高效液相色譜分析反應產物中維生素E的含量。

1.2.4維生素E含量的測定

 高效液相色譜法：色譜條件色譜柱：采用C18柱（長150 mm，內徑4.6 mm，粒徑4～5μm）；流動相：甲醇（色譜醇）+水（去離子水），比例：(98：2)；流速：0.7 m L/min;檢測波長：290 nm;柱溫：25℃±2 ℃，進樣量：20 μL。

1.2.5 VE標準曲線的制作

 實驗室的標準品為液體油狀物，因此用注射器抽取直接滴加到容量瓶中稱量，把容量瓶放在分析天平托盤上然后滴加，稱取維生素E標準品約0.100 g，置50 m L棕色量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成2 mg/m L的溶液作為貯備液。取1 m L貯備液至100 m L的容量瓶中定容。再分別準確移取2，4，5，6，8和10 m L至10 m L的棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到質量濃度分別為4，8，12，16和20 mg/m L的五種溶液，分別經0.45 μm濾膜濾過，濾液作為標準溶液。以標準品溶液質量濃度(x)為縱坐標，峰面積(y)為橫坐標，按照外標法過6點繪制標準曲線．見圖1。得標準曲線為y=1.494 8x×104+2.853×103( R2=0.998 9). 

1.2.6樣品的測定

  精確稱取3份番茄籽脫臭餾出物10 g，以正己烷為溶劑定容至25 m L容量瓶中，再從中取1 m L定容至10m L為待測樣品。超聲處理10 min，用0.45μm的過濾膜進行過濾并上樣，分析條件同2.2.5。

1.2.7單因素試驗

 番茄籽油脫臭餾出物中維生素E的單因素試驗選定水分含量（15%．20%，25%和30%）、料液比(1:3,1:4,l:5,1:6和1:7(mg/m L))、提取溫度（30℃．35℃，40℃，45℃和50℃）、酶用  顯著。量（300，400，500和600 U/g）和酶解時間(8，12，16，20和24 h)等因素進行單因素試驗，考察各因素對維生素E提取率的影響。

1.2.8維生素E提取的響應面試驗設計

 應用Design-Expert 8.05軟件，根據Box-Benhnken中心組合設計原理，以維生素E提取率為響應值，在單因素試驗結果的基礎上，綜合考慮實際生產的需要，對提取溫度、水分含量、料液比和酶用量值四個因素進行響應曲面試驗設計，因素水平見表1，每個組合重復試驗3次。

2結果與分析

2.1維生素E提取體系的選擇

  由圖2可知，該脂肪酶在水相體系中更有利于脂肪酶的酶解作用，甲醇和脂肪酶是親水性的極性物質，而油脂具有疏水性，并且是非極性物質，因此適當的含水量可以提高酶促有機合成的反應速度，增大活化界面，從而使維生素E的提取率增加。

2.2維生素E提取的單因素試驗

2.2.1水分含量對維生素E提取率的影響

  從圖3可以看出，當水分含量低于25%時，隨著水分含量的增加，維生素E提取率逐步增大，當水分含量大于25%時，提取率變化成微下降趨勢，這是因為適量的水分可以降低酯交換反應產物甘油的濃度，可逆反應向右進行使反應更徹底；適量的水分可以使甲醇分子可以分散開一定的距離避免與酶分子直接接觸，這樣會降低了甲醇對酶分子的酶解效果的影響，有利于反應的進行；當水分過量時，增加了副反應水解反應的進行，同時酶濃度隨著水分含量的增加而隨之降低，酶解效率降低。因此水分含量對反應的影響顯著。

2.2.2料液比對酯交換反應的影響

 由圖4可知，當反應體系中水分含量一定時，隨著甲醇用量的增加，維生素E提取率先逐漸增大，當料液比達到1：5( mg/m L)時，提取率最大，再增加甲醇用量時，提取率則逐漸減小。這是因為適量的增加甲醇用量不但可以有共溶的體系也有利于酯交換反應的進行，但甲醇過量的話，甲醇分子在體系中密度會增大，與酶分子的接觸機率增加，因此對酶分子的毒害作用就會加強。甲醇為親水性溶劑，它將脂肪酸活性中心附近的水分溶解，導致脂肪酶構型改變而失活，從而降低酶的活性。

2.2.3酶解溫度對對維生素E提取率的影響

 由圖5可知，溫度對維生素E提取率影響較為顯著。隨著反應溫度的升高，維生素E的提取率逐步增高，當溫度達到40℃時，維生素E的提取率達到最高。當溫度超過40 ℃時，維生素E提取率隨著溫度的升高而降低，這是由于在一定的溫度范圍內，溫度的升高，使得反應底物碰撞頻率增大，酶促酯解反應速度加快，但超過一定范圍，高溫使脂肪酶變性失活；同時高溫使甲醇分子更活躍對酶解效果的影響增加，與此同時，甲醇量的揮發減少會使反應向副反應方向進行，因此，選擇最佳酶解溫度為40℃。

2.2.4酶用量對維生素E提取率的影響

 由圖6可知，當酶用量低于500 U/g時，維生素E的提取率隨著酶用量的增加而增大，當酶用量達到500 U/g后，再增加酶量，提取率不再有明顯的變化。這是因為酶促酯交換反應時，在一定的酶濃度范圍內，脂肪酶濃度越大，反應底物分子與酶分子接觸的頻率越高，酶促酯交換反應進行得越徹底，但是當酶濃度到達相對于底物飽和值時，酶濃度對酯交換反應的影響就不再明顯。因此，最適酶濃度選擇為500 U/g。

2.2.5提取時間對維生素E提取率的影響

 由圖7可知，酶解提取時間低于16 h時，維生素E的提取率隨著時間的延長而增加，當提取時間大于16h時，隨著時間的延長，維生素E的提取率增加幅度微小，這是因為在反應初期，反應底物的濃度較大，有利于酶解正反應的進行；當時間達到16 h時，酶與底物的酯交換反應以近達飽和狀態，反應已趨向平衡，再延長時間對反應影響不明顯，并且易造成維生素E的分解，進而使維生素E的提取率降低。因此，選擇最適酶解提取時間為16 h。

2.3維生素E提取的響應面分析

  結合前期預試驗，由于酶用量及酶解時間對番茄籽油脫臭餾出物中維生素E提取的影響幅度相對較小，故在單因素試驗基礎上，以提取溫度、料液比和水分含量為三個可控工藝參數，以維生素E提取率為指標，采用Box-Behnken設計方法來優化維生素E提取工藝條件，試驗設計方案及分析結果見表2。

 利用Design-Expert 8.05軟件，通過表2中試驗數據進行多元回歸擬合，獲得維生素E提取率對編碼自變量水分值、提取溫度和料液比二次多項回歸方程：

 由回歸方程可知，因此，在一定范圍內可調節水分值、提取溫度和料液比使維生素E的提取率達到所需水平。

 由表3方差分析可以看出，試驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性（p模型<0.000 3），該模型擬合情況較好，可用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。回歸方程的各項方差分析結果表明，一次項和二次項都有顯著性因素，因此各試驗因素對維生素E提取率的影響不是簡單的線性關系。所以，可以利用該回歸方程確定最佳工藝條件。

  F直可以反映各因素對維生素E提取率的重要性，F值越大表明對天然維生素E提取率的影響越大。由表3可知，FA=12.97，FB=6.33，FC=18.06，即各因素對提取率影響程度的大小順序：料液比>水分含量>提取溫度。通過Design-Expert軟件分析，模擬得出提取率最高的優化組合為A=26.31%、B=40.19℃、C=1：5.28（mg/mL），維生素E提取率最高值為43.45%。

  在回歸模型方差分析的基礎上，根據得到的回歸二次方程，利用Design Expert 8.05軟件作水分含量、提取溫度和料液比對提取率影響的響應面圖，分析兩個因素交互作用對維生素E提取率的影響，結果見圖8。

  由圖8可知，在每組交互作用的作用下，維生素E提取率均有最大值，說明各組交互作用均對維生素E提取率有影響。經過確定某一單一因素，在三維圖中查看另一因素的趨勢與之進行對比發現，AB因素之間存在的顯著互交作用，而因素AC、BC交互作用微小，但各圖中兩因素對維生素E提取率影響的大小只能通過方差分析得出，而不能僅依靠等高線的疏密度判斷。通過軟件分析，水分含量26.31%、溫度40.19℃、料液比1：5.28( mg/m L)，維生素E提取率最高值為43.45%。

  考慮到實際操作的情況，將維生素E提取條件修正為水分含量26%、反應溫度40℃、料液比1:5( mg/m L)、酶用量為500 U/g，提取時間16 h，維生素E提取率最高值為42.78%。該值與理論值接近，說明采用響應曲面法優化維生素E的提取工藝可行。

3結論

  通過單因素試驗和響應面優化試驗確定了酶法提取番茄籽油脫臭餾出物中維生素E的最優條件：水分含量26%、反應溫度40℃、料液比1：5(mg/m L)、酶用量為500 U/g，番茄籽油天然維生素E提取率的最高值為42.78%。