葉茂，鄧毛程

1．廣東輕工職業技術學院食品與生物工程系（廣州510300）；2．廣東高校特色調味品工程技術開發中心（廣州510300）

摘要試驗以農產品加工廢棄物為主要原料，采用響應面法對1株高產氨肽酶的米曲霉Y-15固態發酵產酶條件進行優化。應用Plackett- Burman試驗篩選出三個重要影響因子：麥麩、豆粕和水，中心組合響應面試驗對重要影響因子進一步優化，最終確定產酶培養條件為麥麩179.8g豆粕為191.6 g，水的添加量為386 g，在此條件下，氨肽酶的酶活力達到2 879.67 U/g。該米曲霉的培養基成分為農業加工廢棄物，極大降低生產成本，具有一定的生產研究價值。

  關鍵詞  米曲霉；氨肽酶；固態發酵；優化；響應面分析

  氨肽酶是一類從多肽鏈的N端順序水解氨基酸、使氨基酸逐個游離出來的水解酶，其底物作用范圍一般較為廣譜，不僅能夠水解多肽，而且能水解完整的蛋白質分子。氨肽酶主要應用于食品工業中：當蛋白質大分子酶解時，肽鏈中含有的疏水性氨基酸暴露出來，接觸味蕾而呈現苦味，而這些疏水性氨基酸一般位于肽鏈末端，而利用氨肽酶進一步水解蛋白質水解液，可以脫除其苦味；與蛋白酶復合使用，在醬油釀造、魚露生產及其它蛋白水解產品的制備過程中，不僅可以提高蛋白質的利用率，而且能形成風味獨特、滋味鮮美的復合氨基酸水解液。

 氨肽酶不僅存在于高等動物的胰臟、腸液中，也廣泛分布于多種植物、真菌、細菌和原生動物體內，其中對于真菌氨肽酶的結構、功能、調控機制和生產應用等方面已經進行了較為廣泛和深入的研究。目前，國外已有通過曲霉發酵生產氨肽酶，實現了氨肽酶酶制劑商品供應，國內氨肽酶發酵生產及應用方面的研究仍處于起步的階段。米曲霉（Aspergillus oryzae）作為氨肽酶的重要生產菌之一，其發酵工藝條件已經得到了研究，但主要采用的是液態發酵

法。而固態發酵法具有培養基簡單且來源廣泛、能耗低、環境污染較少的優點，并且固態發酵更有利于曲霉的生長繁殖和產酶。因此如何實現氨肽酶的規模化生產、降低成本來滿足商業化的需要，對于提高我國的相關產業發展水平具有重要意義。試驗是在前期試驗篩得到的高產氨肽酶米曲霉Y-15的基礎上，利用農業加工的副產品進行固態發酵法，初步研究其產酶發酵工藝條件，以提高該菌株氨肽酶產酶水平，降低生產成本，為進一步研究利用提供參考。

1  材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

 米曲霉（A．oryzae）Y-15：實驗室從醬油曲種中篩選獲得，斜面保藏于4 0C冰箱。

1.1.2材料與試劑

 碳源（麩皮、甘蔗渣、米糠、木屑）和氮源（豆粕、花生粕、菜籽油餅、玉米粉）：市售；氨肽酶底物（L-亮氨酸-p -對硝基苯胺）：美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3主要儀器與設備

 SW-CJ-ZFD型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養箱：上海博迅實業有限公司；722N型可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1  出發菌株的活化

  將米曲霉菌株接種于馬鈴薯( PDA)培養基進行活化，30℃培養3～4 d，待長滿黃綠色孢子后備用。

1.2.2單孢子懸液的制備

  取培養好的斜面，用無菌生理鹽水洗脫孢子后轉移至裝有玻璃珠的無菌錐形瓶中，充分搖動使孢子散開，用帶脫脂棉的無菌漏斗過濾除去菌絲得到孢子懸液，將孢子濃度調整到5×106個/m L備用。

1.2.3  固態發酵培養

  稱重500～1 000 g的固態發酵培養基置于金屬托盤( 120 cm×100 cm×10 cm)，培養基的配方根據單因素試驗和響應面分析試驗設計，通過添加鹽酸和氫氧化鈉水溶液來調節培養基的初始pH和水分，然后121℃高壓蒸汽滅菌20 min，待培養基冷卻到室溫，將1 m L的5 x 106個/m L的孢子懸液接種到固態發酵培養基中，在30℃下，保持相對濕度在85%，恒溫培養3d。所有的試驗都是平行3次。

1.2.4粗酶液的提取

  分別稱取10 g成曲，研磨后加入100 m L蒸餾水，40℃浸提1h，其間攪拌2～3次。根據不同酶活力測定所需的緩沖液分別定容到合適的稀釋度，用中速定性濾紙過濾，濾液即為粗酶液。同時測定曲料水分，酶活力用曲料干基重量表示，即U/g。

1.2.5氨肽酶活力的測定方法

  采用L-亮氨酸-p-對硝基苯胺為底物測定。

1.3數據處理

  所有數據用Design-Expert 8.07軟件進行分析。

2結果與分析

2.1單因素試驗

  采用單次單因素法，假設各因素間不存在交互作用，1次改變培養基的1個因素的水平而其他因素保持不變，然后逐個進行考察優化，作為Plackett -Burman試驗的準備。

  結果表明，當碳源為麥麩時，氨肽酶的固態發酵酶活力最高(1960±120 U/g)，其它依次為米糠(1230±150 U/g)、甘蔗渣（1026土118 U/g）和木屑( 913±80 U/g)；當氮源為豆粕時，氨肽酶的酶活力最高（2 012±43 U/g），其它依次為玉米粉（1796±108 U/g）、花生粕（1 320±160 U/g）和菜籽油餅（1100土78 U/g）；無機鹽中的Na Cl和K2PO3對氨肽酶的固態發酵酶活力有正相關性，其它的MgSO4、MnSO4、H2O、FeCI3．H2O和CaCl2則沒有影響；接種量為2%時，氨肽酶的固態發酵酶活力達到最高(2 004 ±116 U/g)；初始pH為7.0時，氨肽酶的固態發酵酶活力最高（2 060±88 U/g）；水分含量為50%時，氨肽酶的固態發酵酶活力最高(2 160±90U/g)。

2.2 Plackett-Burman設計試驗確定顯著因素

 在上述單因素試驗結果優化的基礎上，利用Plackett-Burman設計試驗分析米糠（X1）、麩皮（X2）、Na CI（X3）、K2PO3（X4）、玉米粉（X5）、豆粕（X6）、pH（X7）、接種量（X8）和水分（X9）等9個因素的顯著性，每個因素取2個水平(見表1)。并運用軟件進行試驗設計，每個試驗重復3次，對應的響應值取平均值，試驗設計及結果見表2。

 對Plackett-Burman試驗數據進行分析，結果如表3所示。影響米曲霉Y-15固態發酵產氨肽酶的顯著因素分別是麩皮（X2; p=0.014）、豆粕(X6)；p=0.021)和水分（X9；p=0.032）．均小于0.050，可以作為進一步優化的因素，其他因素對結果影響不大，在進一步研究中，取中間水平，對影響效果不進行分析。此外，回歸方程的系數R2=0.988 4，調整后R2Adj =0.936 1，表明多項式模型擬合較好。

2.3最陡爬坡試驗

 根據Plackett-Burman試驗結果，顯著因素豆粕（X6）對酶活力表現為正效應，顯著麩皮（X2）和水分（X9）對酶活力表現為負效應，根據這3個顯著影響因素效應的大小確定試驗的爬坡方向和變化步長，以最快的速度逼近最大響應值（酶活力）的區域，試驗設計與結果見表4。

 由表4可知，顯著因素濃度在試驗6的條件下，酶活力最高(2 630±122 U/g)，因此選擇試驗6的條件作為響應面設計因素水平的中心點，即麩皮（X2）、豆粕（X6）和水分（X9）分別為180，190和360 g。

2.4響應面法優化

  根據中心組合試驗設計原理，設計三因素三水平共20個試驗點的響應面分析試驗，其中14個析因點，6個零點重復，用以估計試驗誤差，以氨肽酶酶活力為響應值，分析米曲霉Y-15固態發酵氨肽酶活力的最佳條件。響應面設計的因素與水平取值見表5，試驗設計與結果見表6。

 以氨肽酶固態發酵的酶活力為響應值，運用Design-Expert軟件進行回歸擬合，得到回歸方程：

  對此模型進行方差分析，結果見表7。從表7可以看出，在a=0.01水平時，模型回歸極顯著( p=0.000 1)，該模型R2=0.989 2，R2Adj=0.978 5，失擬項不顯著( p=0.064 1)，可見該方程對試驗數據進行了很好的擬合。根據模型方程做響應面（圖1），通過該組動態圖可評價諸因素之間對成曲中蛋白酶活力的交互作用，同時可確定各因素的最佳水平及組合，得到X1=-0.04、X2=0.16、X3=0.3，即麥麩為179.8g，豆粕為191.6 g，水為386 g。

按照得到的優化結果將米曲霉接入固態發酵培養基，制曲培養3d，測定成曲中氨肽酶活力，3次平行試驗分別為：2 863，2 901和2 872 U/g，平均酶活力為2 879.67 U/g，預測值Y=2 888.08接近，試驗與預測值有較好的擬合性。

3結論

  試驗考察了碳源、氮源、初始pH、多種金屬離子及水分對米曲霉（A．oryzae）Y-15固態發酵產氨肽酶的影響。在單因素及Plackett-Burman試驗的基礎上，采用中心組合響應面法對發酵條件進行優化，并建立了酶活力與麥麩、豆粕及水的添加量之間的二次多項回歸模型，得出最優發酵條件為麥麩179.8 g，豆粕為191.6 g，水的添加量為386 g，在此條件下，氨肽酶的酶活力達到2 879.6 7 U/g。并且主要培養基成分為麥麩和豆粕，均來源于農業加工廢棄物，成本低廉，而氨肽酶的酶活力較高，為氨肽酶工業化生產的研究提供試驗基礎。