周守毅，  周守琳，  張歡燕

  （上海市環(huán)境監(jiān)測中心，上海200235）

摘要：建立了同相萃取-反相高效液相色譜一質(zhì)譜法對水體中磺胺類、四環(huán)素類、頭孢類、氯霉素等20種抗生素篩查方法。采用水（含0.1%甲酸，0.5 m mol/L甲酸銨）：甲醇（含0.1%甲酸，0.5 m mol/L甲酸銨）作流動相，分別使用電噴霧正離子源和負離子源進行離子化，動態(tài)多反應監(jiān)測方式( DMRM)對20種抗生素的母離子及子離子進行監(jiān)測。采用外標法定量時，抗生素方法的檢出限為0.5～2.5ng/L，R>0.99，回收率介于79.2‰125.5%。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-質(zhì)譜；  抗生素；  快速篩查

中圖分類號：X832  doi：10.3969/j.issn．1003-6504.2016.06.019 文章編號：1003-6504(2016)06-0101-04

 抗生素( antibiotics)是生物包括微生物、植物和動物在內(nèi)在其生命活動過程中所產(chǎn)生的（或由其他方法獲得的），能在低微濃度下有選擇地抑制或影響它種生物功能的有機物質(zhì)。與農(nóng)藥、多氯聯(lián)苯、POPs等化學品所引起的環(huán)境問題受到的長期、廣泛關(guān)注相比，抗生素作為人們?nèi)粘Ｉ�活接觸最為頻繁，用量最大的一類化學品，其環(huán)境行為和效應直到1990年代后期才受到關(guān)注。我國是抗生素的生產(chǎn)和使用大國。2003年僅青霉素產(chǎn)量就為28000t，占世界總產(chǎn)量的60%；土霉素產(chǎn)量10000t，占世界總產(chǎn)量的65%;四環(huán)素產(chǎn)量也為世界第一，在我國的水體中，如九龍江、黃河、黃浦江、海河及巢湖等均檢測到了不同程度的抗生素污染。抗生素的生態(tài)影響主要表現(xiàn)在兩方面：一方面將導致環(huán)境中耐藥菌的出現(xiàn)，并大量繁殖和傳播，最終人類健康造成影響；另一方面通過影響水生生物、動植物的營養(yǎng)傳遞方式和種群結(jié)構(gòu)以及微生物的種群數(shù)量，生態(tài)環(huán)境中固有的食物鏈將會遭到破壞，進而打破生態(tài)系統(tǒng)的平衡。因此，對水體中抗生素污染的監(jiān)測具有重要的意義。本文以水（0.1%甲酸，0.5 m mol/L甲酸銨）：甲醇（0.1%甲酸，0.5 m mol/L甲酸銨）為流動相，通過梯度洗脫分別在正、負離子化的條件下對20種抗生素進行定性篩查，本法操作簡單、重現(xiàn)性好、檢出限低，可用于地表水中抗生素篩查和一些基質(zhì)簡單水體的定量分析。

1實驗部分

1.1儀器與試劑 

Autotrace全自動固相萃取儀（美國ThermoFisher公司）；1290高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；6460三重四級桿質(zhì)譜儀（美國Agilent公司），配有噴射流技術(shù)的電噴霧電離源(AJS)及MassHunter Workstation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，氮吹儀（美國Organomation公司）Oasis HLB 200 mg 6cc小柱（美國Waters公司），Bond Elute PLEX PAX 200 mg，6cc小柱（美國Agilent公司）。

 四環(huán)素( Tetracycline，>98%)、土霉素(Oxytetr -acycline，>98%)、氯霉素( Chloramphenicol，>98%)、磺胺嘧啶( Sulfadiazine，>99%)、磺胺二甲嘧啶( Sulfa-methazine，>99%)、磺胺甲惡唑( Sulfamethoxazole．>98%)、阿莫西林(Amoxicillin，>99%)均為固體微末標樣，購自美國DR．Ehrenstorfer公司。磺甲硝咪唑( Tinidazole)、林肯霉素(Lincomycin)、頭孢唑肟( Ceftizoxime)、氧氟沙星(Ofloxacin)、培氟哌酸( Pefloxacin)、培氟沙星(Norfloxacin)、環(huán)丙沙星( Ciprofloxacin)、氨芐青霉素(Ampicillin)、克林霉素( Clindamycin)、青霉素G(Penicillin G)、交沙霉素( Josamycin)、紅霉素(Erythromycin)、道諾霉素( Daunoru bicin)共13種標樣濃度為1x10-6，由安捷倫中國有限公司提供。

 試劑：甲醇、水均為液質(zhì)純（德國Merk公司）、甲酸為色譜純（美國Dikma公司）和甲酸銨純度>99.0%（美國Fluka公司）、0.47μm孔徑玻璃纖維濾膜（美國What man公司）。鹽酸為優(yōu)級純（美國Merk公司）和氨水為色譜純（美國Fluka公司）。儲備標準溶液的配

制：稱取適量的抗生素固體標準品溶于100 m L甲醇中，-20℃下避光保存。各個濃度的標準工作溶液由儲備標準溶液序列稀釋而成。

1.2樣品的采集、萃取與濃縮

 在上海市某河道采集水樣，每升水樣加入0.5 gNaE DTA，用棕色玻璃瓶避光低溫保存。

 將水樣過0.47μm玻璃纖維濾膜去除顆粒物，用鹽酸和氨水分別調(diào)節(jié)水樣pH到3、5、7和11。抗生索水樣萃取條件如表1所示，回收率范圍在79.2%~125.5%。

 HLB小柱前處理流程：依次用10 m L甲醇、10m L純水預淋洗后，然后以5 m L/min流速將水樣通過固相萃取小柱。上完樣后，用6 m L純水淋洗小柱，再將小柱于氮氣保護下干燥5 min，最后用5 m L0.1%甲酸的甲醇溶液洗脫2次，收集洗脫液在50℃下用氮氣吹干，用甲醇／水( 1:9，V/V)溶液定容至1.0m L，然后用0.22μm的針頭式過濾器過濾后待LC-

MS-MS分析。

 PAX小柱前處理流程：依次用6 m L甲醇、6 m L純水預淋洗后，然后以5 m L/ min 流速將水樣通過固相萃取小柱。上完樣后，用6 m L純水淋洗小柱，再將小柱于氮氣保護下干燥5 min，最后用4 m L 5%甲酸的甲醇／水（1/9，V/V溶液洗脫，將洗脫液過0.22μm的針頭式過濾器后待LC-MS-MS分析。

1.3  色譜與質(zhì)譜條件

 色譜條件：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD液相色譜柱（2.1 mmxl00 mmx1.8μ m），柱溫30℃，流動相A為0.1%甲酸和0.5 m mol/L甲酸銨水溶液；流動相B為0.1%甲酸和0.5 m mol/L甲酸銨的甲醇溶液，流速0.3 m L/min，梯度洗脫：0～0.5 min，10% B;0.5～8 min,10%～32% B;8～9.5 min,32%～65% B;9.5～14 min,65%～75%B；14～15 min，75%～80%B，進樣量：10μL。

 質(zhì)譜條件：電噴霧源(AJS)，采用動態(tài)多反應監(jiān)測( DMRM)，毛細管電壓4 000 V，源溫度350℃，鞘氣溫度400℃：MS1和MS2溫度為100℃，干燥氣流速6 L/min，鞘氣流速12 L/min。

2結(jié)果與討論

2.1  LC-MS/MS條件

 比較甲醇和乙腈為流動相的實驗結(jié)果顯示：甲醇為流動相時，基線穩(wěn)定，各分析物分離良好。在流動相中加入適量甲酸和甲酸銨可以增加抗生素的保留，并改善峰形，促進離子化。因此本實驗采用0.1%甲酸和0.5 m mol/L甲酸銨混合溶液和甲醇作為流動相，大部分化合物都得以較好分離，峰形良好。

 除氯霉素以[M—Hr準分子離子作母離子，其他化合物均以[M+H]+準分子離子作母離子。各抗生素的特征離子以及其他主要的LC-MS/MS參數(shù)見表2。

2.2定性與定量分析

 每種抗生素均選擇一組母離子對于一組子離子對進行監(jiān)測。當樣品中組分的保留時間與標準品一致，并且2個離子對的響應值比例與標準品相對標準偏差<20%，方可確認為目標物。

  在對水體中抗生素定量分析時，基質(zhì)效應影響很大。通常，基質(zhì)效應可導致分析物信號增減，進而影響定量的準確性和可靠性。一旦確認基質(zhì)效應無法消除，須用同位素內(nèi)標進行準確定量。

 由于抗生素種類繁多，同位素內(nèi)標物價格昂貴且部分物質(zhì)購買受到管控，本方法在定量時采用外標法并使用稀釋和基質(zhì)加標的方法降低基質(zhì)效應，所以只適合抗生素篩查和一些基質(zhì)簡單的水樣分析。采用外標法定量時，本方法的檢出限為0.5～2.5 n g/L，R>0.99，回收率介于79.2%～125.5%。

2.3樣品的測定

 應用本方法分析了某處水樣，檢出磺胺類和四環(huán)素類抗生素（見圖1），含量在0.091～0.121μg/L之間（表3），相對標準偏差在3.2%~12.5%之間（n：2）。