張榕欣

  茂名職業技術學院化學工程系（茂名525000）

摘要以女貞子花為原料，研究女貞子花花青素的復合酶協同微波提取工藝及其體外抗氧化活性。結果表明，女貞子花花青素提取最佳工藝條件為纖維素酶和果膠酶按酶活力2:1復合酶解，復合酶用量為0.95%，酶解溫度為49.50C，微波提取時間35 s，乙醇體積分數為89.5%,此時女貞子花花青素的提取率可達7.315 mg/g。女貞子花花青素具有較強清除DPPH。的能力。隨著女貞子花花青素濃度的增加，其清除能力逐漸增強，當花青素濃度大于1.2 mg/m L時，其對DPPH．的清除率大于相同濃度的VC溶液。女貞子花花青素對OH．也有較強清除能力，當女貞子花花青素濃度大于0.9 mg/m L時，其清除OH.的能力總是大于VC,當女貞子花花青素濃度達到2.1 mg/n1L，對OH．的最大清除率可達94.3%。因此，女貞子花花青素有較好的體外抗氧化活性。

關鍵詞女貞子花；花青素：提取：抗氧化

 女貞子為木犀科植物女貞的干燥成熟果實。女貞子花作為女貞子的花蕾，主要含有多糖、氨基酸、脂肪酸等營養成分和黃酮類、三萜類化合物 功能性成分。花青素是一類水溶性的類黃酮化合物，在貞子花中含量豐富。花青素具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力的功效。復合酶協同微波提取植物的黃酮類物質已取得較好的效果，但是目前只有學者用復合酶提取花青素，仍鮮見復合酶協同微波提取花青素的報道。因此，利用響應面分析法優化女貞子花花青素的復合酶協同微波的提取條件，并研究其抗氧化活性，以期為女貞子花資源的深度利用和花青素資源的開發提供另一途徑。

1  材料及方法

1.1原料與試劑

 女貞子花：廣西來賓市嘉禾園藝場；原花青素標準品：上海惠誠生物科技有限公司；乙醇、香草醛、濃鹽酸、鄰二氮菲溶液、VC等，實驗室提供。

1.2試驗儀器與設備

 Discover微波提取器：上海邁科儀器有限公司；Agilent 8453型紫外分光光度計：安捷倫科技有限公司；BF-O2型高速萬能粉碎機：深圳佳榮機械設備有限公司；FA604C分析天平：廣州科美達儀器有限公司；SY-5000型旋轉蒸發儀：深圳特柏惠機電設備有限公司；GT10-1高速離心機：青島儀航實驗設備有限公司等。

1.3試驗方法

1.3.1女貞子花花青素提取工藝流程

1.3.2女貞子花花青素純化工藝流程

 1.3.3女貞子花花青素的測定

 香草醛-鹽酸法測定女貞子花花青素含量。

1.3.3.1  顯色劑配制

 稱取1.000 g香草醛，以甲醇定容至100 m L，為1%香草醛溶液；量取8 m L濃鹽酸，以甲醇定容至100 m L，為8%的鹽酸溶液。1%香草醛溶液與8%的鹽酸溶液按1：1的比例配制，現用現配。

1.3.3.2標準溶液的配制

 準確稱取原花青素標準品100.0 mg置于100 m L容量瓶中，乙醇溶解。分別取原花青素標準溶液0.8，1.6，2.2，3.5，5.0和10.0 m L于6只100 m L容量瓶中，加入5 m L顯色劑，甲醇定容，搖勻。30℃恒溫水浴中避光保溫30 min，以不加顯色劑的空白組作對比，500

 nm處測定系列標準溶液的吸光度。經統計回歸處理，得到線性方程為y=0.575 3X-0.012 6，R2=0.999 7。

 式中：X------標準品的濃度，mg/m L；y------吸光度。

1.3.3.3樣品的測定

 準確移取一定量的樣品溶液于容量瓶中，加入顯色劑，定容，搖勻。以不加顯色劑的空白組作對比，500 nm處測樣品吸光度。

1.3.4女貞子花花青素提取條件的優化

 通過單因素試驗考察復合酶用量、酶解溫度、微波提取時間和乙醇體積分數對女貞子花花青素提取效果的影響，在選取各因素的最優試驗范圍，采用響應面分析法對女貞子花花青素微波提取條件進行優化。

1.3.5  DPPH．清除率的測定

 參考Shimada K等的方法。取女貞子花花青素提取液1.0 m L與10 m L 100 μmol/L的DPPH．溶液加入同一試管中，搖勻，黑暗中放置20 min，測其吸光度，清除率計算如式(1)：

1.3.6羥自由基(OH．)清除能力的測定

 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定。

2結果與分析

2.1酶種類對女貞子花花青素提取效果的影響

 從圖1看出，當選用單一的酶時，女貞子花花青素提取率較低，只有選用果膠酶時，女貞子花花青素提取率為4.465 mg/g。這可能是因為催化植物細胞間質（即果膠質）水解成半乳糖醛酸和果膠酸，有利于胞內有效成分花青素的溶出。當兩者酶復合使用時，女貞子花花青素提取率提高，特別是纖維素酶和果膠酶復合使用時，女貞子花花青素提取率最高，達到5.652 mg/g。這是可能因為兩種酶之間存在協同作用，降低了花青素從胞內向提取介質擴散的傳質阻力，促進了傳質過程。因此，提取女貞子花花青素時，選擇果膠酶和纖維素酶復合使用。

2.2果膠酶和纖維素酶添加比例對女貞子花花青素提取效果的影響

 由圖2可知，果膠酶和纖維素酶以2：1活力比添加時的花青素提取率較高，高于按其他比例的提取率。故選擇果膠酶和纖維素酶的添加比例為2：1。

2.3女貞子花花青素復合酶協同微波提取條件的優化

2.3.1復合酶用量對女貞子花花青素提取效果的影響

  設定酶解溫度為50℃，微波提取時間為30 s，乙醇體積分數為70%，分別在復合酶用量為0.2%，0.4%．0.6%，0.8%．1.0%和1.2%六個梯度下，按照1.3.1和1.3.2的方法提取女貞子花花青素并且測其提取率。由圖3可以看出，復合酶用量為0.8%時，女貞子花花青素提取效果較好。

2.3.2酶解溫度對女貞子花花青素提取效果的影響

 設定復合酶用量為0.8%，微波提取時間為30s，乙醇體積分數為70%，分別在酶解溫度為40 0C, 450C，50 0C，55 0C，60 0C和65 0C六個梯度下，按照1.3.1和1.3.2的方法提取女貞子花花青素并且測其提取率。由圖4可以看出，酶解溫度為50℃時，女貞子花花青素提取效果較好。

2.3.3微波提取時間對女貞子花花青素提取效果的影響

 設定復合酶用量為0.8%，酶解溫度為50 0C，乙醇體積分數為70%，分別在微波提取時間為10，20,30，40，50和60 s六個梯度下，按照1.3.1和1.3.2的方法提取女貞子花花青素并且測其提取率。由圖5可以看出，微波提取時間為30 s時，女貞子花花青素提取效果較好。

2.3.4  乙醇體積分數對女貞子花花青素提取效果的影響

 設定復合酶用量為0.8%，酶解溫度為50 0C，微波提取時間30 s，分別在乙醇體積分數為70%，75%,80%，85%，90%和95%六個梯度下，按照1.3.1和1.3.2的方法提取女貞子花花青素并且測其提取率。由圖6可以看出，乙醇體積分數為85%時，女貞子花花青素提取效果較好。

2.3.5女貞子花花青素的優化試驗

 結合單因素試驗結果，分別選取復合酶用量為0.6%，0.8%和1.0%；酶解溫度為45 0C, 50 0C和550C；微波提取時間為20，30和40 s：乙醇體積分數為80%，85%和90%。利用響應面分析法優化女貞子花花青素提取最佳工藝參數。因素水平見表1，結果見表2。

  對女貞子花花青素提取進行分析，復合酶用量、酶解溫度、微波提取時間和乙醇體積分數都是顯著因素。關于女貞子花花青素的提取率二次回歸擬合方程：

  式中：A-----復合酶用量；B-----酶解溫度；C-----微波提取時間；D-----乙醇體積分數。

 由表3可以看出，模型的p<0.000 1，而失擬項的p=0.849 4，說明了女貞子花花青素提取的模型與實際情況擬合程度比較好，可以預測女貞子花花青素提取的條件。

 由方差分析結果可以看出，AB的交互作用、AC的交互作用 、AD的交互作用、BC的交互作用、BD的交互作  CD的交互作用都顯著，根據女貞子花花青素提取試驗結果和回歸方程各項的方差分析，由響應面分析法優化出女貞子花花青素提取最佳工藝條件為：復合酶用量為0.95%，酶解溫度為49.5℃，微波提取時間35 s，乙醇體積分數為89.5%。

2.4女貞子花花青素抗氧化活性研究

2.4.1  女貞子花花青素對DPPH．的清除能力的測定

 當自由基清除劑存在時，DPPH．會與孤對電子配對，溶液顏色變淺，所以吸光度變小，表示抗氧化能力越強。DPPH．法操作簡單而且反應靈敏，目前被廣泛用于多種天然產物的抗氧化能力評價。由圖7可知，在試驗濃度范圍內，女貞子花花青素添加量增加，DPPH．清除率升高。當花青素濃度小于1.2mg/m L時，其對DPPH．的清除率小于對照組VC，而且差異顯著，然而當花青素濃度大于1.2 mg/m L時，其對DPPH．的清除率大于相同濃度的VC溶液。因此，女貞子花花青素具有較好的清除DPPH．的能力。

2.4.2女貞子花花青素對羥自由基(OH．)清除能力的測定

 OH．可使鄰二氮菲-Fe2+，氧化為鄰二氮菲一Fe3+，溶液的紅色逐漸淡去，吸光度逐漸降低。由圖8可以看出，隨著濃度增大，女貞子花花青素對OH．的清除能力逐漸增強，增強的速度明顯大于對照組VC。當女貞子花花青素濃度小于0.9 mg/m L時，其清除OH．的能力小于VC，當女貞子花花青素濃度大于0.9 mg/m L時，其清除OH．的能力總是大于VC，且兩者差距有逐漸拉大的趨勢。當女貞子花花青素濃度達到2.1 mg/m L，對OH．的最大清除率可達94.3%。這說明女貞子花花青素具有較強的清除OH．的能力。

3結論

 女貞子花花青素提取最佳工藝條件為：纖維素酶和果膠酶按酶活力2：1復合酶解，復合酶用量為0.95%，酶解溫度為49.5℃，微波提取時間35 s，乙醇體積分數為89.5%，此時女貞子花花青素的提取率可達7.315 mg/g。

 女貞子花花青素具有較強清除DPPH．的能力。隨著女貞子花花青素濃度的增加，其清除能力逐漸增強，當花青素濃度大于1.2 mg/m L時，其對DPPH．的清除率大于相同濃度的VC溶液。女貞子花花青素對OH．也有較強清除能力，當女貞子花花青素濃度大于0.9 mg/m L時，其清除OH．的能力總是大于VC，當  女貞子花花青素濃度達到2.1 mg/m L，對OH.的最大清除率可達94.3%。因此，女貞子花花青素較好的體外抗氧化活性。