作者單位：276003山東省臨沂，臨沂市人民醫院重癥醫學科（張建國、陳曉娟）;南昌大學第一附屬醫院重癥醫學科（丁成志、邵強、曾振國、劉芬、錢克儉）
　　通信作者：錢克儉，Email：qkj0607@sohu.com
　　microRNA是一類大小約22個核苷酸長度的內源性非編碼小分子RNA^[1]，主要通過識別并結合靶基因 mRNA 的3’端非編碼區，在轉錄后水平抑制蛋白的翻譯或促進靶基因的降解^[2-3]。有研究發現微小RNA參與肺內炎癥反應的調控^[4]，miR-146a是其中較有代表性的一個。本課題組前期研究發現，用LPS刺激肺泡巨噬細胞，miR-146a的表達水平升高，并且升高程度與TNF-α mRNA呈負相關^[5];轉染miR-146a能下調LPS誘導肺泡巨噬細胞TNF-α的表達^[6]，表明miR-146a能抑制LPS誘導肺泡巨噬細胞的炎癥反應。本實驗擬進一步探討miR-146a調控肺泡巨噬細胞炎癥反應的機制，為體內試驗提供理論依據。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　大鼠肺泡巨噬細胞NR8383（上海中國科學院細胞庫）;LPS（E.coli 0111：B4）;Pre-miRTM miR-146a前體、CyTM3標記的Pre-miRTM陰性對照（美國ABI公司）;大鼠 TNF-α ELISA 檢測試劑盒（上海森雄科技實業有限公司） ; PrimeScript逆轉錄試劑盒、SYBR熒光染料試劑Ⅱ（SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ）PCR 檢測試劑盒（大連寶生物工程有限公司）;抗IRAK-1 抗體，抗TRAF-6 抗體、抗NF-κB p65抗體（美國abcam公司）。
　　1.2實驗分組及處理
　　將體外培養的 NR8383 細胞按每孔1.5×106個接種至6孔板，每孔2 mL，每組2個復孔。轉染組轉染50 nmol/L的Pre-miRTM miR-146a前體，對照組轉染50 nmol/L 的 CyTM3 標記的 Pre-miRTM 陰性對照，搖勻后繼續培養24 h，隨后加入1 μg/mL 終質量濃度的 LPS 處理細胞6 h，離心收集細胞和上清液，-80 ℃保存。
　　1.3檢測指標及方法
　　1.3.1免疫熒光法觀察 NF-κB p65 核移位情況將細胞爬片放置于24孔板;甲醇丙酮固定細胞，0.5%TritonX-100 PBS 透化細胞;再放入含10%驢血清的 PBS 中4 ℃封閉;孵育一抗：用0.5%TritonX-100 PBS稀釋兔抗 NF-κB p65（1∶50），常溫下孵育4 h后漂洗;孵育二抗：用10%驢血清的 PBS 稀釋 Alexa Flour 488 驢抗兔綠色熒光標記二抗（1∶200），室溫下孵育20 min后漂洗;用 Dapi 染核，滴加防熒光粹滅劑、固定封片，在Olympus IS71倒置熒光顯微鏡下拍照分析。
　　1.3.2ELISA 檢測 TNF-α 蛋白含量收集細胞上清液，按照 ELISA 試劑盒操作說明書步驟操作檢測 TNF-α 蛋白含量。
　　1.3.3RT-qPCR 檢測 IRAK-1、TRAF-6 及TNF-α mRNA 表達采用 TRIzol 法提取細胞內總 RNA，通過紫外分光光度計測定總 RNA 濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測總 RNA 完整性及純度。按照 PrimeScript逆轉錄試劑盒說明書操作，所有操作均在冰上完成。10 μL 的逆轉錄反應體系：PrimeScript 緩沖液 2μL，PrimeScript 逆轉錄酶復合物 10.5 μL，多聚胸腺嘧啶引物 0.5 μL，隨機的6核苷酸引物 0.5 μL，總RNA 500 ng，加無核酶水至總體積10 μL。反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。20 μL 的 PCR反應體系包括：cDNA 2 μL，上游引物 0.8 μL，下游引物 0.8 μL，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，無核酶水6 μL。反應條件：95 ℃ 30 min，40個擴增循環（95 ℃ 5 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 27 s）。選取β-actin 作為內參，檢測IRAK-1 mRNA、TRAF-6 mRNA及TNF-α mRNA的表達，相對表達量采用2-ΔΔCt計算。引物序列及長度見表1。
　　1.3.4IRAK-1、TRAF-6、NF-κB p65 蛋白表達收集細胞，離心，棄上清，提取總蛋白或分別提取胞核蛋白、漿蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。完成聚丙烯酰胺凝膠電泳（每孔加樣20 μL）、轉膜、封閉，孵育一抗，兔抗 IRAK-1（1∶2000）、兔抗 TRAF-6 （1∶1000）、兔抗 NF-κB p65（1∶500）和鼠抗 β-actin（1∶3000）/兔抗 Lamin B1（1∶1000），4 ℃孵育過夜，漂洗3次;孵育二抗，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 、山羊抗鼠 IgG（1∶4000），37 ℃孵育1-2 h，漂洗3次，暗室內曝光、顯影并定影，行X膠片掃描，通過 Quantity One 軟件進行數據分析，檢測 IRAK-1、TRAF-6及胞漿NF-κB p65蛋白以 β-actin 作為內參，細胞核內NF-κB p65蛋白以 Lamin B1作為內參。
　1.4統計學方法
　　采用 SPSS 17.0 統計軟件分析數據，數據以均數±標準差（x±s）表示，兩樣本比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。
　　2結果
　　2.1過表達 miR-146a 對 LPS 誘導的 NR8383 細胞 NF-κB p65 核移位的影響
　　2.1.1免疫熒光法觀察細胞 NF-κB p65 核移位的變化倒置熒光顯微鏡下觀察到NF-κB p65 呈綠色熒光，Dapi 染核后呈藍色熒光。與對照組比較，觀察到轉染組 NF-κB p65 胞核中表達減少，胞漿中增多。見圖1。
　　2.2過表達 miR-146a 對 LPS 刺激的NR8383細胞 TNF-α表達的影響
　　 與對照組相比較，RT-qPCR 檢測NR8383細胞轉染miR-146a后TNF-α mRNA表達下調至（0.47±0.06）倍（P<0.05）;ELISA 檢測TNF-α蛋白表達也明顯下降（211.5±30.39）pg/mL vs.（616.6±42.28）pg/mL，P <0.01。見圖3。
　　2.3過表達 miR-146a 對 LPS刺激的NR8383細胞 IRAK-1和TRAF-6蛋白表達的影響
　　 與對照組比較，過表達miR-146a后，轉染組IRAK-1 mRNA增加為（1.16± 0.1）倍，TRAF-6 mRNA增加為（1.19± 0.16）倍，差異均無統計學意義（P>0.05）;轉染組IRAK-1 蛋白下降為（0.73±0.05）倍，TRAF-6 蛋白下降為（0.64±0.09）倍，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖4。
　　3討論
　　 miR-146a 是第一個被發現能夠調節免疫系統的微小RNA，當機體存在有感染、腫瘤時miR-146a 表達上調^[7-9]，上調人單核細胞白血病細胞（THP-1細胞）的 miR-146a 后將負性調控炎癥因子的釋放^[10]。研究證實在 LPS誘導的肺泡巨噬細胞炎癥反應中 miR-146a 表達上調;本研究發現過表達 miR-146a 后，用 L

　　 PS 刺激肺泡巨噬細胞， NF-κB 核移位受到抑制，TNF-α mRNA 表達下降，上清液中 TNF-α 蛋白含量也明顯下降，提示 miR-146a 能夠抑制 LPS 誘導的肺泡巨噬細胞炎癥反應。
　　筆者進一步實驗發現，過表達 miR-146a 后，IRAK-1 mRNA 和 TRAF-6 mRNA 表達量無明顯變化，而 IRAK-1 和 TRAF-6 蛋白表達下降。Taganov 等^[11]研究發現 LPS 刺激 THP-1 細胞后，miR-146a 表達上調，并通過突變試驗和熒光素酶報道基因試驗證實，miR-146a 的靶基因是 TLRs/NF-κB 通路中的兩個接頭蛋白編碼基因 IRAK-1和TRAF-6。TLRs/NF-κB 是經典的炎癥信號通路，當LPS 刺激肺泡巨噬細胞，可與細胞膜表面 TLR4 結合，導致 IRAK-1 自身磷酸化，繼而活化 TRAF-6，使其與轉化生長因子 β活化激酶1（TAKl）及 TAKl 的結合蛋白（TAB）形成復合物，導致 IκB 磷酸化和降解，最終使 NF-κB 移位進入核內，啟動相關基因轉錄翻譯生成 TNF-α 炎癥因子^[12-13]。有研究表明過表達 IRAK-1 能夠使 HEK293 細胞和 THP-1 細胞中NF-κB 呈劑量依賴性增加，同時 TNF-α 也增加，而敲除 IRAK-1 基因能降低 LPS 誘導的 THP-1 細胞^[14-15]炎癥反應;同樣過表達或者敲除 TRAF-6 也產生相同的作用。
　　參考文獻
　　[1]Carthew RW， Sontheimer EJ. Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs[J]. Cell， 2009， 136（4）：642-655.
　　[2] Lewis BP， Burge CB， Bartel DP. Conserved seed pairing， often flanked by adenosines， indicates that t housands of human genes are microRNA targets[J]. Cell， 2005， 120（1）：15-20.
　　[3]熊旭明，張振輝，江子欣，等.MicroRNA-29a在脂多糖誘導人單核細胞凋亡中的作用和機制[J].中華急診醫學雜志，2013， 22（1）：40-45.
　　[4]Moschos SA， Williams AE， Perry MM， et al.Expression profiling in vivo demonstrates rapid changes in lung microRNA levels following Lipopolysaccharide-induced inflammation but not in the anti-inflammatory action of glucocorticoids [J].BMC Genomics， 2007，17（8）：240.
　　[5]曾振國，龔洪翰，李勇，等.脂多糖誘導大鼠肺泡巨噬細胞中microRNA-146a 與TNF-α 的相關性研究 [J]. 中華急診醫學雜志， 2012， 21（7）： 709-712.
　　[6]劉芬，曾振國，聶成，等.轉染微小RNA-146a對肺泡巨噬細胞腫瘤壞死因子-α 表達的影響[J].中華危重病急救醫學，2013，25（6）：335-338.