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    玉米胚芽蛋白水解物的制備及其抗氧化活性研究

     王文1,黃繼紅1*,楊銘乾1,2,李海月1,紀小國,

     1.河南工業大學生物工程學院(鄭州450001);2.鄭州市中食農產品加工研究院(鄭州450001)

    摘要為高效利用脫脂玉米胚芽蛋白,采用雙酶分步酶解制備玉米胚芽蛋白水解液,通過單因素和響應面試驗設計對酶解條件進行優化;利用膜分離對其進行初步純化并測定其體外抗氧化活性。結果表明,一步酶解的最佳條件:堿性蛋白酶的加酶量為0.58%, pH 8.65,酶解4.78 h時,蛋白溶出率為57.70%+1.92%;二步酶解的最佳條件:木瓜蛋白酶加酶量0.11%,pH 6.54,酶解2.28后,蛋白溶出率達88.71%+1.5%;不同分子段蛋白質水解物均具有較強的自由基

    清除能力和一定的還原力。純化組分中<3 kDa肽段(E1)對超氧陰離子自曲基的清除效果最好,有望作為一種有效的抗氧化肽,在醫藥、食品和飼料行業等發揮應用優勢。

    關鍵詞雙酶分步酶解;蛋白溶出率;膜過濾:抗氧化活性

      玉米胚芽是玉米深加工產業最具附加值的副產品,脫脂后,其蛋白含量在20%左右,且其氨基酸組成較為均衡,人體必需氨基酸含量高于大豆和小麥中的含量,與FAO/WHO推薦的人類蛋白質標準具有很好的一致性。采用蛋白酶水解技術可有效將其功能基團釋放出來。徐力等分離純化玉米胚芽蛋白酶解物,得到結構為Leu-Asp-Tyr-Glu短肽,并驗證此短肽具有抗氧化活性。玉米胚芽蛋白酶解物含有豐富的纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等,可用于生產抗疲勞或運動后機體恢復的營養補給劑或作為改善肝病、腎病和腸道障礙等患者的補給劑;此外玉米胚芽肽還可制成功能食品,具有降血壓、降膽固醇、抑制腫瘤細胞增殖的功能。

      目前,單酶酶解玉米胚芽蛋白的報道相對較多,陳彥平、丁繼峰等采用木瓜蛋白酶對玉米胚芽蛋白進行酶解,水解度在14%左右。任建等利用2709堿性蛋白酶水解玉米胚芽蛋白,水解度可達22.46%,但其加酶量(5%)和調漿用水均較大。單酶酶解普遍存在原料利用率低、產品生理活性弱等問題。但由于酶本身也是蛋白質,同時加入兩種不同的酶,可能引起兩酶間的相互水解,或者不同蛋白酶之間產生競爭性抑制從而影響水解速度,且不同蛋白酶的最佳水解條件存在差異性。因此,試驗采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步酶解脫脂玉米胚芽,可有效提高蛋白溶出率;利用膜過濾對水解物進行初步的分離后,測定各組分對羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力及總還原力,分析各水解組分的抗氧化活性,以期獲得一種高抗氧化活性的玉米胚芽肽或酶解組分。

    1  材料與方法

    1.1試驗材料試劑

     脫脂玉米胚芽粕(含蛋白18.2%):湖北常香油脂股份有限公司提供;堿性蛋白酶,木瓜蛋白酶均購于Solarbio公司;鄰二氮菲,鄰苯三酚,GSH等均為分析純。

    1.2主要儀器與設備

     雷磁pH計PHS-3E:上海精密科學儀器有限公司;UV-1000紫外分光光度計:天美(中國)科學儀器有限公司;半自動凱氏定氮儀:濟南海能儀器股份有限公司;實驗型膜分離設備(雙工位平板膜):賽普(無錫)膜科技發展有限公司。

    1.3試驗方法

    1.3.1工藝流程

    1.3.2蛋白溶出率的測定

      按照凱氏定氮法(GB/T 5009.5-2010)測定酶解液和原料中粗蛋白含量,蛋白溶出率的計算如式1所示。

    1.3.3酶解液抗氧化活性測定

     包括羥自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力和總還原力的測定。

    1.3.4酶解條件的優化

    1.3.4.1第一步酶解:堿性蛋白酶對玉米胚芽酶解效果的影響

     利用堿性蛋白酶對脫脂玉米胚芽粕進行酶解后,調pH 7.0,得混合物A,滅酶離心,測定玉米胚芽蛋白溶出率以評價酶解效果。分別考察堿性蛋白酶添加量(酶/底物重)(0.2%,0.4%,0.6%,0.8%和1.0%),酶解時間(1,2,3,4和5 h)和pH( 7.5,8.0, 8.5,9.0和9.5)對蛋白溶出率的影響。

    1.3.4.2第一步酶解:響應面優化試驗

     根據1.3.4.1單因素試驗選擇試驗條件進行響應面試驗,利用Design-Expert 8.0.6進行Box-Behnken試驗設計,以加酶量(X1)、酶解時間(X2)和酶解pH(X3)為試驗因素,蛋白溶出率為評價指標,采用三因素三水平的分析方法,對堿性蛋白酶的試驗條件進行優化。試驗因素與水平設計見表1。

    1.3.4.3第二步酶解:木瓜蛋白酶對玉米胚芽蛋白酶解效果的影響

     將1.3.4.1所得混合物A加木瓜蛋白酶酶解后,調pH 7.0,滅酶離心,測定玉米胚芽蛋白溶出率。分別考察木瓜蛋白酶添加量(0.04%,0.08%,0.12%,0.16%和0.20%),酶解時間(0.5,1.5,2.5,3.5和4.5 h),pH(5.0,5.5,6.0, 6.5和7.0)對玉米胚芽蛋白溶出率的影響。

    1.3.4.4第二步酶解:響應面優化試驗

     根據1.3.4.3單因素試驗結果,利用響應面法分析加酶量(A)、酶解時間(B)和酶解pH(c)的最佳值。試驗因素與水平設計見表2。

    2結果與分析

    2.1第一步酶解:堿性蛋白酶對玉米胚芽蛋白溶出率的影響

    2.1.1單因素試驗

     由圖1可知,蛋白溶出率隨加酶量的不斷增加而升高,當加酶量達0.6%以后,溶出率的變化趨于平緩。這是因為在底物濃度一定的情況下,提供給酶作用的肽鍵數是一定的,酶量飽和后,加酶量的增大對蛋白溶出率的影響不顯著,最適加酶量在0.60%左右。

     由圖2可知,酶解反應大致分為兩個階段,4h之前蛋白溶出率增加迅速,而4h之后,溶出率變化明顯變緩。這可能是由于反應剛開始時,堿性蛋白酶濃度最高,活性最大,因此反應速度較快;隨著反應的進行可參加反應的酶量減少,活性下降,反應速度放緩,表現為蛋白溶出率幾乎不再增加。因此,堿性蛋白酶的酶解時間以4h左右為宜。

      由圖3可知,玉米胚芽蛋白溶出率隨pH的升高而增加,pH 8.5時,蛋白溶出率最大,其原因是隨pH的增加,蛋白質與水之間的相互作用力增強,蛋白質溶解性提高,有利于酶解的進行;而當pH為8.5~9.5時,堿濃度過高導致酶解系統黏度增加,進而導致蛋白提取率下降。另外,pH過高容易使蛋白質分子脫氨、脫羧、肽鍵斷裂,同時會發生“胱賴反應”,把氨基酸轉化成有毒的化合物,影響酶解物的安全,因此,堿性蛋白酶的最適pH為8.5。

    2.1.2響應面試驗

      響應值二次模型的方差分析及顯著性如表4所示。由表4可知,模型p<0.000 1,模型極顯著,失擬項p=8 727>0.05不顯著。因此,二次模型成立,可用此模型分析和預測堿性蛋白酶的酶解條件。分析其顯著性,可知加酶量、酶解時間及pH對蛋白溶出率影響極顯著;加酶量和酶解時間的交互作用顯著影響蛋白溶出率。交互作用的響應曲面及等高線如圖4所示。

     通過Design-Expert軟件分析,由Design-Expert軟件分析出堿性蛋白酶的最佳工藝參數為:加酶量0.58%、酶解4.78 h、pH 8.65,此時玉米胚芽蛋白理論溶出率為59.62%,在相應條件下進行3次驗證試驗,此條件下蛋白溶出率為57.70%,實際值與理論值相近,誤差僅為1.92%,表明模型建立合理,預測的結果較為準確。

    2.2第二步酶解:木瓜蛋白酶對玉米胚芽蛋白溶出率的影響

    2.2.1單因素試驗 

    由圖5可知,木瓜蛋白酶可顯著增加玉米胚芽蛋白的最終溶出率,考慮酶解效果和酶解成本,選擇0.12%作為最適加酶量。

     酶解時間對蛋白溶出率的影響如圖6所示,在酶解時間為0.5~2.5 h時,蛋白溶出率呈直線增加,在2.5~4.5 h內,蛋白溶出率基本保持不變。且時間過長可能導致多肽的過度水解,因此選擇2.5h為最佳酶解時間。

     不同pH對玉米胚芽蛋白溶出效果的影響趨勢如圖7所示,可知pH過大或過小均不利于蛋白的酶解,這可能與玉米胚芽結構改變有關。因此,木瓜蛋白酶的最適pH為6.5。

    2.2.2第二步酶解:響應面優化試驗

     利用Design-Expert 8.0.6軟件對表5中的數據進行二次多元回歸擬合,得到加酶量(A)、酶解時間(B)和pH對蛋白質溶出率(Y)的影響的預測方程

     由回歸方差分析(表6)可知,模型p=0.000 1,極顯著;方程失擬項p=0.190 6>0.05不顯著,試驗誤差小,說明模型擬合可靠。方程一次項A、B、C極顯著,二次項A2、C2極顯著,B2顯著,交互項AC、BC不顯著,AB顯著。因此,各試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系,表明回歸模型的意義和真實度良好,加酶量、酶解時間和酶解pH對蛋白質溶出率的影響極為顯著;加酶量和酶解時間兩因素間的交互作用顯著。交互作用的響應曲面及等高線如圖8所示。

     通過Design-Expert軟件分析,預測出木瓜蛋白酶的最佳工藝參數為加酶量0.11%,酶解時間2.28 h,pH6.54,蛋白質溶出率的最大預測值為90.06%,在此條件下進行3次重復試驗,蛋白質溶出率約88.71%,試驗誤差僅為1.5%,接近模型預測蛋白質溶出率。

    2.3抗氧化試驗結果

      研究表明,10 kDa以下肽類均對機體具有顯著的免疫調節作用和抗氧化活性;Jumeri等以海鞘為原料制備的分子量在5.0±1.0 kDa,3.6±0.1  kDa的肽類具有較強的抗氧化和抗腫瘤活性。也有資料表明,分子量在2.5~3 kDa的肽類具有較為理想的抗氧化能力,但多肽的抗氧化活性主要與暴露的氨基酸側鏈基團和肽序列有關。

    2.3.1  自由基清除能力的測定

      玉米胚芽蛋白富含具有生物活性的氨基酸序列。由圖9可知,各組分均具有較好的自由基清除能力。濃度均為1 mg/m L時,五種樣品的羥自由基清除率均高于GSH,是GSH清除能力的1.22~1.54倍;而分子量小于3 kDa的玉米胚芽肽在5種樣品中具有最強的DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除能力,分別為GSH清除能力的0.6倍和1.12倍。可知,小于3 kDa肽樣的自由基清除能力與GSH基本相當,證明以脫脂玉米胚芽粕為原料制備抗氧化活性肽的方法是可行的。

    2.3.2總還原力的測定

     總還原力常用來評價天然抗氧化劑給出電子或給出氫的能力。由圖10可知,30~100 k Da樣品的還原力最高,但僅達到GSH的41.78%,這可能與樣品中有效抗氧化肽的含量有關。

    3結論與展望

     通過雙酶分步酶解玉米胚芽蛋白,單因素、響應面試驗及實際試驗驗證,確定酶解玉米胚芽蛋白的最佳工藝條件為:堿性蛋白酶加入量0.58%,pH 8.65,酶解4.78 h后;再加0.110%的木瓜蛋白酶,pH 6.54,酶解2.28 h后,玉米胚芽蛋白溶出率高達88.71%±1.5%,溶出率與一步酶解相比提高31%左右。膜過濾和抗氧化試驗結果表明,玉米胚芽蛋白酶解物和各純化組分均具有較好的抗氧化活性;其中小于3 kD a肽段(E1)對超氧陰離子自由基的清除效果最好,作為天然的抗氧化物,E1具有低毒高效的優勢,有望在醫藥、食品和飼料行業等發揮應用優勢。

     雖然試驗較為系統的制備了玉米胚芽蛋白酶解物,并對不同分子量段酶解物進行了抗氧化活性測定,但抗氧化肽(<3 k D a肽段)分子量的準確確定及抗氧化機理等還需進一步研究。

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